Caracterização molecular e celular de proteínas hnRNPA/B em neurônios

• Processo: 15/13151-2
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2015
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2017
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Roy Edward Larson
• Beneficiário: Roy Edward Larson
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Neurociências
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: agregação protéica | hnRNP | lulas Doryteuthis | proteina RNA ligante | Sh-Sy5Y | terminal presináptico | Neurociencia

Resumo

Identificamos e purificamos uma proteína ligante de RNA de 65 kDa (p65) como um membro da família de heterogêneo nuclear ribonucleoproteínas, subclasse A/B (hnRNPA/B) nos terminais pré-sinápticos dos neurônios fotorreceptores de lulas (Lico et al., 2010; 2015). A caracterização molecular desta proteína revelou que em lulas há pelo menos 11 transcritos que codificam hnRNPA/B-like proteínas com alto grão de homologia. Entre eles, clonamos e expressamos em bactéria a hnRNPA/B-like proteína 2, que possui propriedades que implicou-a como subunidade da p65. Demonstramos que p65 é um dímero estável em SDS, ureia e DTT composto de subunidades de qual pelo menos uma é hnRNPA/B-like proteína 2 (Lico et al.,2015). Complexos ribonucleoproteínas participam em processos de splicing, translocação e estabilidade de mRNA no citoplasmo, e regulação local-específico de tradução. Recentemente, mutações em proteínas hnRNPA/B foram implicadas em doenças neurodegenerativas, pela indução ou facilitação de formação de corpos de inclusão no citoplasmo. Estes fatos, em conjunto com a localização do p65 na região pré-sináptica de neurônios de lula e a facilidade de isolar os axônios e sinapses gigantes destas lulas, levarem-nos a investigar as propriedades moleculares e celulares do p65. Com o intuito de identificar os componentes de complexos ribonucleoprotéicos na região sináptica de neurônios e entender a formação de agregados e inclusões citoplasmáticas, fatores em neurodegeneração, pretendemos aplicar metodologia de centrifugação em gradiente de sacarose (Lico et al., 2015), pull-down (Lico et al., 2015) e imunoprecipitação para isolar e caracterizar os complexos RNPs de neurônios de lulas. Para obter pistas de sua distribuição subcelular e função, pretendemos investigar a localização da proteína endógena e a expressão de proteína recombinante em células neuroblastoma SH-SY5Y em cultura, um modelo in vitro para a diferenciação e funcionalidade neuronal. Esperamos que nossos resultados podem contribuir para compreender as propriedades moleculares de p65 especificamente (e proteínas hnRNPA/B-like em geral) e seu papel junto com RNA na regulação da função pré-sináptica. (AU)