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EMU concedido no processo 15/50040-4: microscópio confocal TCs SP8 DLS Hyvolution

Processo: 16/19391-8
Linha de fomento:Auxílio à Pesquisa - Programa Equipamentos Multiusuários
Vigência: 01 de novembro de 2016 - 31 de outubro de 2023
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
Pesquisador responsável:Ana Marisa Chudzinski-Tavassi
Beneficiário:Ana Marisa Chudzinski-Tavassi
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:15/50040-4 - Rational approach for searching molecular targets involved in inflammatory events and cell survival, AP.PCPE
Assunto(s):Química de macromoléculas  Microscópio eletrônico  Fluorescência  Equipamentos multiusuários 
As informações de acesso ao Equipamento Multiusuário são de responsabilidade do Pesquisador responsável
Página web do EMU:http://butantan.gov.br/pesquisa/equipamentos-multiusuarios
Tipo de equipamento:Caracterização de Materiais - Microscopia ótica - Confocal
Fabricante: Leica
Modelo: TCS SP8 DLS Hyvolution.

Resumo

A microscopia de epifluorescência, comumente utilizada para a análise da distribuição de componentes celulares por meio de imunomarcação, é uma técnica clássica bastante presente em diferentes áreas de pesquisa. Mesmo assim, ela sofre de uma importante limitação: a falta de nitidez. Esse artefato é causado pela excitação de todo o campo de visão, o qual ativa a emissão de toda a espessura da amostra. A natureza da excitação desta técnica de microscopia dificulta a análise de estruturas grossas, uma vez que a luz fora do plano focal diminui o contraste da amostra de maneira significativa. A microscopia confocal de fluorescência foi desenvolvida para contornar este artefato excluindo a detecção de luz fora do plano focal, por meio do uso de um "pinhole". As imagens adquiridas desta forma são nítidas e apresentam contraste que pode ser visualizado por toda a espessura da amostra, com melhoria da resolução tanto lateral quanto axial. Esta forma melhorada de visualizar as amostras gera grande ganho de informação, uma vez que apresenta as estruturas em 3 dimensões de forma consistente, mesmo em estruturas espessas. Outras melhorias da detecção do sinal são relevantes, uma vez que a aquisição confocal possibilita a aquisição espectral de amostras marcadas por múltiplos fluoróforos, modo crucial para aquisição de imagens de amostras vivas. Este modo pode ser utilizado na sua melhor forma quando implementada com unidades de detecção individuais para cada marcação, e a separação espectral feita por meio de dispositivo altamente transparente, como um prisma. Estas características permitem a aquisição de imagens sem o vazamento de sinal entre canais, condição mandatória para ensaios de colocalização, e bom mínimo efeito fototóxico à amostra. O uso de escaneamento a laser na microscopia confocal possibilita novas abordagens a aquisição de imagens. Ensaios dinâmicos podem ser realizados para investigar o comportamento de células ao longo do tempo, a mobilidade de componentes subcelulares por FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), ou mesmo experimentos de espectroscopia de correlação de fluorescência circunscritos ao volume confocal de interesse. O uso do laser também possibilita novas formas de se adquirir imagens das amostras. A microscopia de iluminação de plano seletivo (SPIM), descrita no início do século XX, vem ganhando mais destaque nos últimos anos. Esta técnica, também conhecida por Lighsheet, desacopla o caminho da luz de excitação do de emissão, e consequentemente diminui drasticamente os efeitos de perda de fluorescência por exposição a luz. Nesta abordagem, uma fina camada de luz excita apenas o volume a ser detectado. Assim, imagens de grandes volumes podem ser adquiridas de forma rápida, com seccionamento óptico preservado e com impacto mínimo a amostra. Estes atributos fazem com que a microscopia SPIM seja uma ótima abordagem para a aquisição de imagens em áreas como biologia do desenvolvimento, culturas de células em 3D e experimentos de longa duração. A combinação destas duas modalidades de microscopia - confocal e "lightsheet"- trazem algumas vantagens, como velocidade, manipulação de amostras mais intuitivo e a possibilidade do uso dos lasers da microscopia confocal para foto manipulação de amostras que serão vistas através da técnica SPIM. Utilizando um espelho montado no plano focal da objetiva de detecção, é possível integrar estas duas formas de análise de amostras em um instrumento multimodal que pode atender a diferentes necessidades de grupos de pesquisas, com perguntas biológicas diversas, fazendo deste equipamento um ótimo candidato para uma plataforma de imagens multiusuário. (AU)