Estudo de redes de contato envolvidas na modulacao da especificidade pelo substrato em uma beta-glicosidase empregando a tecnica de sdsl.

• Processo: 11/50103-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Sandro Roberto Marana
• Beneficiário: Lúcio Mário Ferreira de Mendonça
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 08/55914-9 - (bioen/pronex FAPESP) Development of beta-glycosidases designed to improve the efficiency of noncomplexed cellulase systems, AP.BIOEN.TEM
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Beta Glicosidases | Sdsl | Vias De Contato

Resumo

A especificidade pelo substrato nas beta-glicosidases é modulada por um conjunto conservados de resíduos do sítio ativo (E, Q, N, H e W) que interage diretamente com o glicone do substrato (monossacarídeo posicionado antes da ligação glicosídica hidrolisada). Além destes, na beta-glicosidase Sfbgli, resíduos externos ao sítio ativo influenciam a especificidade pelo substrato, possivelmente através de ligações não-covalentes (vias de contatos) que os conectam aos resíduos do sítio ativo. Propõe-se que efeitos de mutações nestes resíduos externos se propaguem através da via de contato atingindo os resíduos conservados do sítio ativo, modificando a interação com o glicone e conseqüentemente a especificidade de Sfbgli. Vias de contato já foram observadas em diversas proteínas através de métodos computacionais de análise da estrutura protéica. Contudo, não há demonstrações experimentais de propagação de efeitos através destas vias. Buscando avaliar esta possibilidade, neste projeto através de metagênese sítio dirigida um resíduo de cisteína substituirá o nucleófilo catalítico de Sfbgli e em seguida este resíduo do sítio ativo receberá a marcação específica com um marcador de spin (metanotiosulfonato-MTSSL). Posteriormente, em duplo-mutantes com alterações também introduzidas em resíduos (posições) intermediários e externos na via de contato que liga o nucleófilo aos resíduos do exterior do sítio ativo, buscaremos alterações no espectro de EPR da sonda que possam evidenciar que as mutações mesmo externas ao sítio ativo tenham se propagado até seu interior. Caso, mutações introduzidas fora das vias de contato não tenham o mesmo efeito sobre o espectro de EPR, teremos indicações de que o conjunto de resíduos de uma via de contato atuariam de fato formando uma via por onde é mais provável a propagação de efeitos motivacionais. (AU)