Otimização de iniciadores para diagnose de OGMs por PCR em Tempo Real

• Processo: 12/00317-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2012
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2013
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Haiko Enok Sawazaki
• Beneficiário: Silvio Henrique Reginato Grandi
• Instituição Sede: Instituto Agronômico (IAC). Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA). Secretaria de Agricultura e Abastecimento (São Paulo - Estado). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 11/12232-8 - Otimização da diagnose de soja e milho geneticamente modificados por PCR em tempo real, AP.R
• Assunto(s): Técnicas de diagnóstico molecular Milho Soja
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: BRYT Green | milho | quantificação OGM | soja | Diagnóstico molecular

Resumo

A reprodutibilidade e repetibilidade de uma reação de PCR em Tempo Real depende primordialmente de ambiente controlado, equipamentos calibrados, bons reagentes e iniciadores e, operador altamente qualificado. O operador deve ser muito bem treinado para realizar as reações, com extremo cuidado para evitar contaminação e possibilitar a confiabilidade nos resultados. É portanto, extremamente importante, se ter uma pessoa altamente qualificada que possa auxiliar nas operações de manuseio e realização das análises e organização. O objetivo é o credenciamento de pelo menos um evento pelas normas da ISO 17025. A realização de análises de OGMS por uma instituição oficial com ISO17025 visa facilitar os processos do agronegócio, visto a detecção e quantificação de organismo geneticamente modificado (OGM) ser exigência em quase todos os países para os quais o Brasil exporta alimentos. A bolsista deverá auxiliar nas operações de reação de PCR e de extração de DNA, assim como na organização e preenchimento das fichas necessárias, para se alcançar o nível de confiabilidade nos resultados e se ter a organização que possibilite a implantação da Iso 17025. A confiabilidade dos resultados de uma análise baseada em reação de PCR em Tempo Real, além das condições de assepsia, ambiente totalmente controlado com mudança de ambiente para cada tipo de operação (isto é, realizar a operação de mistura da reação em um ambiente e a operação de colocar os DNAs, utilizando diferentes pipetas, em outro ambiente para evitar contaminação), depende primordialmente dos equipamentos estarem calibrados, bons reagentes e iniciadores e, operador muito bem treinado. Para os iniciadores, além das condições pré-estabelecidas (com 50 a 150pb pois quanto menor o tamanho do fragmento amplificado, maior a eficiência de amplificação porque possibilita maior número de vezes de troca do sítio da enzima, conteúdo G/C de 30 a 80% com os 5 nucleotídeos da extremidade 3'com até 2 Cs e /ou Gs, evitar repetição de bases e o convencional de não serem complementares, não formarem hairpin, com Tms próximos), é importante sua otimização. A otimização determina a concentração mínima dos iniciadores que fornece o menor CT com maior magnitude do sinal gerado pelas condições de PCR, enquanto minimiza amplificação não específica. Serão realizados as análises com as misturas de concentrações dos primers abaixo especificados:Reverse Primer (nM)Forward Primer (nM)503009005050/50300/50900/5030050/300300/300900/30090050/900300/900900/900Para a implantação da ISO 17025, é necessária a descrição de vários formulários referente a metodologia de execução (recebimento de amostra, preparação de amostra, extração de DNA, quantificação de DNA, identificação do evento, garantia de qualidade dos resultados de análise), além das metodologias de operação de equipamentos (operação da balança, operação da autoclave, operação cabine de PCR, operação do Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systems, etc). Ainda, é necessário o preenchimento de fichas para cada tipo de operação, assim como de fichas de controle de entrada e saída de reagentes, de controle e manutenção de equipamentos, de controle de calibração de equipamentos, de controle de numeração dos boletins de análise, etc. Além da parte referente ao responsável como compras, avaliação, treinamento, auditoria, etc. A bolsista além da realização das operações de extração de DNA e análises de PCR, também auxiliará na organização e preenchimento das fichas necessárias para que seja possível a implantação da Iso17025.