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Fator de crescimento de queratinócitos e interleucinas 1 beta, 6, 8, 10, 12 e fator de necrose tumoral alfa no meio de cultura de fibroblastos dérmicos de pacientes com queimaduras

Processo: 11/24092-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de março de 2012
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2014
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Cirurgia
Pesquisador responsável:Alfredo Gragnani Filho
Beneficiário:Anthony Gueratto Klepp
Instituição-sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Cirurgia plástica   Mediadores da inflamação

Resumo

Introdução: Resposta inflamatória intensa é desencadeada em queimadura que acomete grande extensão corpórea. As citocinas são mediadores da resposta inflamatória à injúria térmica promovendo a comunicação entre diversos tipos de células. Portanto, espera-se que entre as citocinas, as interleucinas 1, 6, 8, 10 e 12, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), assim como o fator de crescimento de queratinócitos (KGF) estejam alteradas nos pacientes com queimadura que acometa acima de 25% do corpo, que são os grandes queimados. Estima-se isso pelo fato da produção de citocinas e de KGF serem dois mecanismos conhecidos de reparação tecidual. Objetivo: Avaliar o nível de citocinas e KGF no meio de cultura de fibroblastos dérmicos humanos cultivados de pacientes com grande extensão de queimadura em comparação a pequena queimadura. Métodos: O presente estudo possui um delineamento de pesquisa experimental, in vitro, observacional, analítico, controlado, realizado em centro único. O projeto foi submetido à Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo e aprovado sob o número 0842/11. Procedimento operatório: A obtenção dos fragmentos de pele que seriam descartados e que são necessários para o início do cultivo dos fibroblastos será realizada através do procedimento operatório padrão utilizado para o tratamento de queimados da Unidade de Tratamento de Queimaduras da Disciplina de Cirurgia Plástica da UNIFESP/EPM/HSP. A cultura será iniciada pelo método enzimático utilizando colagenase. Após a digestão do tecido, a suspensão será filtrada através de um filtro de 100 µm e centrifugada a 400g por 10 min. As células serão semeadas em garrafa de cultura, subcultivada e utilizada na quarta passagem. No meio de cultura sobrenadante será avaliada a presença de citocinas e KGF através da citometria de fluxo para a detecção de citocinas e do método de ensaio imunoenzimático para a detecção de KGF. Concentrações de IL-1beta, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 e TNF-alfa serão analisados no meio de cultura de células de pacientes com queimadura pelo Cytometric Bead Array Human Inflammation Kit (CBA, BD Biosciences, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O material consiste de esferas, cada esfera com anticorpo específico ligado à citocina. As amostras serão analisadas pelo citômetro FACSCalibur. O ensaio imunoenzimático para detecção do KGF no meio de cultura de fibroblastos humanos primários utilizara o KGF human Quantikine®, seguindo as orientações do fabricante. Todos os experimentos serão realizados em triplicatas. Serão cinco pacientes no grupo experimento com extensão de queimadura acima de 25% e o grupo controle será de cinco pacientes com extensão de queimadura menor que 5%. Será utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon para análises pareadas e o de Friedman para análises múltiplas. O nível de significância estatística será fixado em 0,05 e assinalado com asterisco quando os valores apresentarem diferença estatística.