Perfil microbiológico e resíduos de antibióticos no leite de vacas com mastite clínica e subclínica submetidas a tratamento

• Processo: 13/12734-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2013
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2014
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Medicina Veterinária - Medicina Veterinária Preventiva
• Pesquisador responsável: Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro
• Beneficiário: Jéssica Eugênia Padella Braga
• Instituição Sede: Instituto de Zootecnia. Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios (APTA). Secretaria de Agricultura e Abastecimento (São Paulo - Estado). Nova Odessa , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 12/00855-3 - Perfil microbiológico e resíduos de antibióticos no leite de vacas com mastite clínica e subclínica submetidas a tratamento, AP.R
• Assunto(s): Leite Mastite bovina Microbiologia veterinária
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Leite | mastite | residuo antimicrobiano | Mastite e Qualidade do leite

Resumo

Plano de atividades para o próximo que serão acompanhadas pelo bolsista: teste fenotípico para a avaliação da formação de biofilmes. Teste do Ágar Vermelho Congo. A produção biofilmes de cepas de Staphylococcus aureus através de sua morfologia será avaliada em Ágar Vermelho Congo (CRA) (0,8g de corante vermelho congo para 1 litro de Brain Heart Infusion Ágar (BHI) e 50 gramas de sacarose) (FREEMAN et al., 1989). As placas de Ágar Vermelho Congo serão inoculadas e incubadas à 37ºC por 24 horas, seguido por uma incubação à temperatura ambiente por 48 horas. Serão utilizadas também as cepas de S. aureus (ATCC 25923) e (ATCC 12228), para fins de controle positivo e negativo respectivamente. Teste em microplacas de poliestireno. A capacidade de produção de biofilmes "in vitro" das estirpes de S. aureus será determinada utilizando-se microplacas estéreis de poliestireno inerte de acordo com o 13 método citado por STEPANOVIC et al. (2007). Um volume de 20 ¼l de suspensão bacteriana (0.5 McFarland) adicionadas a 180 ¼l de TSB suplementado com 0.25% de glicose serão colocados em cada um dos poços da placa de microtitulação de poliestireno que serão incubadas por 18 horas à 35ºC. Os poços serão lavados 3 vezes com 200¼L de solução salina estéril. A fixação das células à placa será realizada com 150 ¼L de metanol por 20 minutos e posteriormente estas serão secas à temperatura ambiente por 30 minutos. As placas serão coradas com cristal violeta 0,5% por 15 min. Será adicionado etanol por 30 minutos para suspender novamente as células aderidas na fenda da placa. A absorbância será determinada à 492nm em um leitor de ELISA. Poços não inoculados contendo TSB com glicose servirão como branco. Os resultados serão classificados como forte, moderado, fraco e não produtor de acordo com STEPANOVIC et al. (2007). FREEMAN, D. J.; FALKINER, F. R.; KEANE, C. T. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. Journal of Clinical Pathology, v. 42, p.872-874, 1989.STEPANOVIC, S.; VUKOVIC, D.; HOLA, V.; DI BONAVENTURA, G.; DJUKIC, S.; CIRKOVIC, I.; RUZICKA, F. Quantifications of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. Apmis. 115(8): 891-899, 2007. Teste imunoenzimático para detecção de resíduos de antibiótico no leite. Para a obtenção do soro policlonal duas coelhas da raça Nova Zelândia, com 45 dias de idade serão imunizadas em intervalos de quinze dias com o imunógeno preparado (100 ¼L da suspensão de gentamicina), sendo a primeira imunização com Adjuvante Completo de Freund na proporção de 2:1; a segunda com Adjuvante Incompleto de Freund também na proporção de 2:1, ambas subcutâneas e, as subsequentes com Tampão PBS por via intraperitoneal. A cada imunização, uma alíquota de sangue será coletada de um corte realizado na orelha para separação do soro e titulação. Após cinco imunizações as coelhas serão sacrificadas para efetuar a coleta de todo o sangue. A leitura da densidade óptica será realizada no leitor de ELISA (DUARTE, 2007). A otimização do ELISA será efetuada conforme os protocolos descritos anteriormente (CROWTHER, 1995; DUARTE et al., 2002). Serão avaliados a diluição dos antissoros, o sistema de bloqueio do ensaio (BSA ou leite Molico), a concentração dos reagentes de coloração e melhor tipo de ELISA a ser utilizado. Os tempos para cada passo do ensaio também serão otimizados, de modo a permitir uma melhor visualização dos resultados. (AU)