Caracterização dos genes Nr2e1 como possíveis marcadores de células-tronco / progenitoras na hipófise de zebrafish (Danio rerio)

• Processo: 15/04770-0
• Linha de fomento: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Mestrado
• Vigência (Início): 26 de julho de 2015
• Vigência (Término): 25 de janeiro de 2016
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Luciani Renata Silveira de Carvalho
• Beneficiário: Caroline Caetano da Silva
• Supervisor no Exterior: Wenbiao Chen
• Instituição-sede: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Local de pesquisa : Vanderbilt University (VU), Estados Unidos
• Vinculado à bolsa: 14/05349-4 - Caracterização do gene Nr2e1 como possível marcador de célula-tronco/progenitora na hipófise de zebrafish (Danio rerio), BP.MS
• Assunto(s): Endocrinologia Doenças da hipófise Hipopituitarismo Receptores nucleares órfãos Células-tronco neurais Expressão gênica Sistemas CRISPR-Cas Peixe-zebra

Resumo

Este projeto tem como objetivo testar a hipótese de que Prop1 regula a expressão do Nr2e1 e que poderia ser responsável pela proliferação e diferenciação hipofisária. O Nr2e1 é um receptor nuclear hormonal órfão, que é essencial para a manutenção de células tronco neurais e neurogênese, mas nunca foi descrito seu papel na hipófise. Camundongos Ames com mutação espontânea no gene Prop1 tem hipopitutiarismo congênito com deficiência, LH / FSH, PRL, TSH e GH associados a displasia hipofisária/ hipoplasia. A expressão de Nr2e1 encontra-se aumentada na hipofise do camundongo Ames. O camundongo disponível com nocaute do Nr2e1, é agressivo, caro para importar, além de ter uma manutenção de alto custo, o que o torna impróprio para os nossos estudos. Em vez disso, escolhemos o zebrafish para testar a hipótese desse projeto devido aos baixos custos de manipulações genéticas e facilidade de manutenção. A FAPESP apoiou o meu projeto de mestrado para ser realizada no Brasil. Inicialmente a proposta era de usar morfolino para nocautear o gene Prop1, a fim de avaliar a expressão de Nr2e1 e depois nocautear o Nr2e1 para avaliar os seus alvos. A abordagem com o morfolino é propenso a efeitos não específicos e só é eficaz para avaliação no animal de no máximo até 7 dias do desenvolvimento, devido à diluição relacionado ao crescimento. A melhor alternativa para avaliar o fenótipo do animal adulto são os ensaios CRISPR / Cas. Esta nova ferramenta de edição de genoma permite uma alteração específica e a substituição de uma única base no gene de interesse, resultando em mutações hereditárias permanentes. Embora esta técnica tenha sido amplamente utilizada em outros países, tais conhecimentos não estão disponíveis no Brasil. Proponho, portanto, gerar animais com mutações no Prop1 e Nr2e1 usando o sistema CRISPR / Cas em um laboratório dos Estados Unidos com muita experiência nesse ensaio e que possa nos auxiliar a estudar a função de genes durante os períodos com demanda metabólica hipofisária em animais com hipopituitarismo congênito. (AU)