Vias de sinalização envolvidas na indução de apoptose de neutrófilos pelos ácidos oleico e linoleico

• Processo: 15/07815-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2015
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Fisiologia - Fisiologia Geral
• Pesquisador responsável: Adriana Cristina Levada-Pires
• Beneficiário: Eliane Borges da Silva
• Instituição Sede: Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 10/50848-8 - Participação das espécies reativas de oxigênio e ceramidas na morte de neutrófilos humanos induzida por ácidos graxos, AP.JP
• Assunto(s): Estresse do retículo endoplasmático Neutrófilos Ácidos graxos Apoptose Ácido oleico Sobrevivência celular Quimiluminescência Western blotting
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: ácidos graxos | apoptose | estresse de reticulo endoplasmatico | neutrófilos | Fisiologia

Resumo

O estresse de retículo endoplasmático é um mecanismo protetor que visa impedir a formação de proteínas mal formadas, no entanto a instalação prolongada deste mecanismo pode induzir a apoptose de neutrófilos e outros tipos celulares. Estudos recentes demonstraram que os ácidos graxos podem induzir estresse de retículo em neurônios, no entanto o efeito destes metabólitos no retículo endoplasmático de neutrófilos ainda não foi estabelecido. Nosso grupo demonstrou que ácidos oléico e linoléico na concentração de 250 µM induzem apoptose de neutrófilos humanos após cultivo por 3 horas. A possível participação do estresse de reticulo endoplasmático na apoptose de neutrófilos induzida por ácidos graxos e as vias de sinalização envolvidas neste processo permanecem a serem elucidadas. Deste modo, neste estudo será investigado a indução do estresse de retículo endoplasmático pelos ácidos oléico e linoléico e o possível envolvimento do estresse de retículo endoplasmático na apoptose de neutrófilos humanos provocada por estes ácidos graxos. Neutrófilos humanos serão previamente tratados por um período máximo de 3 horas (durante 1, 2 e 3 horas), com os ácidos oléico e linoléico em concentração não tóxica (100 µM) e tóxica (250 µM) em seguida será determinada a indução de estresse de retículo endoplasmático pelos ácidos oléico e linoléico através dos ensaios de marcação do estresse de retículo endoplasmático (por sonda ER- tracker, citometria), expressão gênica da proteína clivada XBP-1 (por PCR) e quantificação das proteínas envolvidas no estresse de retículo endoplasmático: PERK, pPERK, peIF2±, IRE-1 e pIRE1 (por western blotting). Além disso, também será determinado a participação do estresse de retículo endoplasmático na morte de neutrófilos induzida por ácidos graxos, através da quantificação das proteínas envolvidas no estresse de retículo endoplasmático: CHOP, GRP78, Ero-1, JNK e ASK (por western blotting) e da determinação da produção de ROS por neutrófilos tratados com os ácidos (através do método de quimioluminescência utilizando lucigenina). Além disso, a importância do estresse de retículo endoplasmático na apoptose de neutrófilos induzida pelos ácidos graxos testados será investigada através da avaliação da viabilidade celular e fragmentação de DNA após cultivo dos neutrófilos com inibidor de estresse de retículo endoplasmático 4PBA prévio a adição dos ácidos graxos. As comparações estatísticas das médias serão realizadas por análise de variância (ANOVA, One-way, não-paramétrico) seguida pelo teste de comparações múltiplas Tukey- Kramer. O nível de significância será de p < 0,05. Será utilizado Software GraphPad Prism - versão 4.03.