Desenvolvimento do procedimento de microscopia de fluorescência para identificação das proteínas virais nas membranas das células S2

• Processo: 16/03856-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2016
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Renato Mancini Astray
• Beneficiário: Nayara Gomes Luiz Santos
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 15/11327-6 - Expressão de proteínas estruturais de Alphavirus em células S2 (D. melanogaster) para estudos de imunização e diagnóstico, AP.R
• Assunto(s): Imunofluorescência Vírus Mayaro Virologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Células S2 | imunofluorescência | Vírus Mayaro | Virologia

Resumo

O procedimento será aplicado para a identificação das proteínas estruturais do MAYV. Serão testados: a melhor quantidade de células aderidas à lamínula destinada à análise (1 x 104 células até 1 x 106); melhor tempo de coleta das células após a indução da expressão da proteína recombinante (24, 48 ou 72 horas); melhor método de fixação celular, a partir do teste de diferentes fixadores (acetona, metanol ou p-formaldeído); metodologia de lavagem e bloqueio para diminuição da interferência de fundo (tampão de lavagem, utilização de detergentes fracos, utilização de bloqueadores de porção Fc, utilização de soroalbumina bovina, etc...); melhores diluições das amostras de soro a serem utilizadas e do anticorpo secundário marcado com fluoróforo (fluoresceína, ficoeritrina, alexa, etc..); melhor método de armazenamento das lâminas pré-análise e, por fim, a definição do tempo de armazenamento apropriado, de modo a conservar as características do teste. O procedimento será padronizado pela utilização de anticorpos de coelho anti-MAYV disponíveis, utilizando como suporte as células S2 estavelmente transfectadas com o vetor pMt/E3E2-Mayaro. A posterior utilização de soro humano contendo anticorpos anti-MAYV será determinante para a definição da utilidade da metodologia proposta (colaboração da Dra Maria Paula Mourão da Fundação de Medicina Tropical de Manaus). As lâminas serão visualizadas com o microscópio de fluorescência BX51 acoplado a sistema de imagem adquirido no último auxílio deste pesquisador (FAPESP 2012/24647-0).