Estudos do core complex do T4SS de Xanthomonas citri por crio-microscopia eletrônica

• Processo: 16/13824-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2016
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Shaker Chuck Farah
• Beneficiário: Germán Gustavo Sgro
• Supervisor: Gabriel Waksman
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of London, Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 14/04294-1 - Estudos estruturais e funcionais do Sistema de Secreção do Tipo IV de Xanthomonas citri, BP.PD
• Assunto(s): Biologia estrutural Xanthomonas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia Estrutural | Competição bacteriana | Crio-microscopia eletrônica | Secreção de macromoléculas | Sistema de secreção do tipo IV | Xanthomonas | Biologia estrutural de proteínas

Resumo

Um dos principais objetivos deste projeto de pós-doutorado é a obtenção de informação estrutural sobre o complexo central (core complex) do Sistema de Secreção de Tipo IV de Xanthomonas citri, o qual forma o poro através de ambas camadas de membrana (interna e externa) do envelope bacteriano. Este complexo é composto de 14 cópias de cada uma das subunidades VirB7, VirB9 e VirB10. Devido ao grande tamanho deste complexo (~1,2 MDa) e sua associação com a membrana bacteriana, o método de escolha para a análise estrutural é a técnica de Cryo-microscopia eletrônica (Cryo-EM). Até agora, avançamos significativamente no nosso trabalho sobre o core complex do T4SS de Xanthomonas. Começando com a sua expressão em E. coli, fomos capazes de purificá-lo da membrana usando detergentes suaves em combinação com cromatografia de afinidade e de exclusão por tamanho. A caracterização inicial das partículas, utilizando microscopia electrónica por contraste negativo (NS-EM) indicam que elas são de formato toroidal, com uma simetria semelhante ou igual à simetria C14 observada para os complexos dos plasmídeos conjugativos pKM101 e R388 descritos pelo grupo do Dr. Gabriel Waksman no Birbeck College, Londres. Além disso, recentemente tivemos sucesso na preparação de grades para análise por Cryo-EM. Estes resultados preliminares, obtidos em colaboração com o grupo do Dr. Rodrigo Portugal no Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano-CNPEM) em Campinas, são extremamente promissores e sugerem que estamos muito perto de estar prontos para recolher conjuntos de dados definitivos de NS-EM e Cryo-EM para construir modelos 3D do complexo central do T4SS de Xac. Estes modelos nos dará as primeiras vistas estruturais na organização do invulgar T4SS das Xanthomonadaceae e vai proporcionar avanços significativos em nossa compreensão da forma como esta máquina realiza a sua função ao nível molecular. Para atingir este objetivo, temos estabelecido uma colaboração com um laboratório de classe mundial com a expertise e infra-estrutura necessárias para realizar a análise de microscopia eletrônica de alta resolução, bem como experiência em estudos estruturais dos T4SSs. A presente proposta de uma bolsa de estudos BEPE descreve nossos planos para uma visita de 6 meses para o laboratório do Dr. Gabriel Waksman no Birkbeck College, em Londres. Durante esta visita, o Dr. Germán Sgro terá acesso a uma infra-estrutura altamente moderna de Cryo-EM e terá oportunidade de interagir intensamente com um grupo poderosamente competente que se especializa em estudos de EM de sistemas de secreção bacterianos.