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Validação de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) com antígenos recombinantes no diagnóstico sorológico da Leishmaniose Visceral (LV) Canina

Processo: 17/03367-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de junho de 2017
Vigência (Término): 31 de maio de 2019
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina - Anatomia Patológica e Patologia Clínica
Pesquisador responsável:Hiro Goto
Beneficiário:Mahyumi Fujimori
Instituição-sede: Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Leishmaniose visceral animal   ELISA   Testes sorológicos

Resumo

No Brasil, a Leishmaniose Visceral (LV) está em franca expansão, presente em todas as regiões, com prevalência de 3.253 casos em 2013, atingindo, nas três últimas décadas, também centros urbanos e periurbanos. Na transmissão da LV no Brasil, o flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis é o principal vetor, e o cão (Canis familiaris) e a raposa (Dusycion vetulus), envolvidos no ciclo domiciliar e silvestre, respectivamente, são os principais reservatórios. Consequentemente, as medidas de controle da transmissão consideram esses elementos, mas, neste projeto, o foco será o cão infectado por L. (L.) infantum. Os cães infectados por L. (L.) infantum podem apresentar-se, do ponto de vista clínico, como assintomáticos, oligossintomáticos ou sintomáticos. Como estes apresentam um intenso parasitismo na pele, acredita-se que isto permita uma fácil infecção do vetor constituindo-se no elo importante na manutenção da cadeia epidemiológica. Desta forma, a identificação de cães infectados é considerada uma medida crucial no controle da transmissão da doença, sendo recomendada a realização de inquérito amostral ou censitário, dependendo da situação epidemiológica com relação ao risco de transmissão na área a ser investigada. Embora o exame parasitológico positivo em material de aspirado de medula óssea ou linfonodos seja o parâmetro incontestável, sendo este impraticável em inquéritos caninos, utilizam-se métodos sorológicos para o diagnóstico da LV canina (LVC). Nesse sentido, o Ministério da Saúde recomenda a realização de teste imunocromatográfico DPP™ Leishmania test para triagem dos cães e confirmação dos casos positivos por ELISA baseado em lisado total de Leishmania major-like. Visto que a cultura do parasito para preparo do antígeno total se constitui em fator limitante, seria desejável que houvesse um ELISA baseado na utilização de antígeno recombinante, o que propomos neste projeto. Baseados nos dados de pesquisa na Espanha, para pesquisa de anticorpos anti-leishmânia utilizando proteína de choque térmico (heat shock protein = Hsp) Hsp83 de L. (L.) infantum na LVC, testamos esse antígeno no teste ELISA nas leishmanioses humanas, que mostrou boa sensibilidade e especificidade. Em estudos preliminares do ELISA com rHsp83 (ELISA-rHsp83) com soros de cães submetidos a exame parasitológico obtivemos alta sensibilidade (88,9%) e alta especificidade (94,4%). Vale ressaltar que temos o plasmídeo contendo o gene hsp83 de L. (L.) infantum e a expressão e a produção do antígeno recombinante rHsp83 padronizadas, sendo a sua produção em escala maior, pré-industrial, em teste no nosso laboratório. O antígeno rK28 foi inicialmente construído como proteína quimérica baseada na fusão de epítopos de rK9, rK26 e rK39 de L. infantum apresentando elevada sensibilidade (99%) e especificidade (96%) em teste ELISA com cães da Itália. Recentemente, o antígeno rK28 foi produzido como poliproteína de fusão, a partir da síntese do gene K28, que compreende regiões haspb1 de L. donovani (homólogo de K26 de L. infantum), cinesina de L. donovani (homólogo de K39 de L. infantum) e haspb2 de L. donovani (homólogo de K9 de L. infantum). Em amostras de LV humana, o ELISA-rK28 apresentou sensibilidade de 96,8-99,6% e especificidade de 96,2-100,0%. Portanto, com base em relatos da literatura e estudos de nosso grupo, consideramos que os testes ELISA-rHsp83 e ELISA-rk28 são bons candidatos para uso no diagnóstico de LVC em inquéritos sorológicos em áreas endêmicas. Deste modo, o presente estudo pretende validar os métodos sorológicos ELISA-rHsp83 e ELISA-rK28 para o diagnóstico de LV canina em substituição ao ELISA baseado em lisado total de Leishmania major-like, como teste confirmatório, pós-teste imunocromatográfico DPP™ Leishmania test. Validar, alternativamente, os métodos sorológicos ELISA-rHsp83 e ELISA-rK28 para o diagnóstico de LV canina como teste confirmatório, independentemente do resultado do DPP™ Leishmania test. (AU)