Detecção de mutações no DNA mitocondrial associadas à Neuropatia Óptica hereditária de Leber

• Processo: 19/05522-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2019
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2020
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina - Clínica Médica
• Pesquisador responsável: Adriana Berezovsky
• Beneficiário: Felipo Victor Moura
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/05869-9 - Avaliação da função das células ganglionares da retina pela resposta fotópica negativa na neuropatia óptica hereditária de Leber, AP.R
• Assunto(s): Oftalmologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: mutações DNA mitocondrial | neuropatia óptica hereditária de Leber | Oftalmologia

Resumo

Neste projeto o bolsista realizará o screening das principais mutações associadas à Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (NOHL) através do método de sequenciamento de Sanger. Serão analisadas três mutações localizadas nas posições 11778, 14484 e 3460 do DNA mitocondrial (DNAmt). Análise de outras regiões do DNAmt também poderá ser realizada nos casos sem as principais mutações mas que apresentem padrão clínico e eletrofisiológicos altamente indicativos de NOHL. Adicionalmente, o bolsista realizará uma análise da adequação do DNA obtido de saliva em relação à detecção destas mutações específicas e portanto como fonte de DNA para diagnóstico. Objetivos: Os objetivos científicos do projeto são: (1) Detecção de mutações associadas à NOHL em pacientes com características clínicas e eletrofisiológicas compatíveis com a doença. (2) Análise da adequação do DNA obtido de saliva para a detecção diagnóstica das três principais mutações associadas à NOHL. Descrição do Plano: O bolsista realizará os seguintes procedimentos:Extração de DNA: (1) recebimento das amostras, obtenção de precipitados de leucócitos (sangue) ou células da mucosa buca, no caso de saliva. (2) Extração de DNA, seguido de checagem da integridade e qualidade da amostra de DNA obtido. Esta etapa será realizada através de avaliação do DNA genômico em eletroforese em gel de agarose 0.8%.Amplificação das regiões de interesse para sequenciamento: (1) Amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction) das regiões compreendendo os pontos específicos das três principais mutações. (2) Checagem dos produtos de PCR em gel de agarose. (3) Purificação dos produtos de PCR que serão submetidos ao sequenciamento de Sanger. Análise por enzima de restrição: (1) Digestão de produtos de PCR com enzimas de restrição específicas para as mutações. (2) Eletroforese dos produtos digeridos em gel de agarose ou poliacrilamida. (3) Análise dos resultados.Sequenciamento das regiões de interesse: (1) Os produtos purificados serão submetidos à reação de sequenciamento, com dois primers para cada posição analisada. Após a reação, estes produtos serão purificados e submetidos a eletroforese em Sequenciador automático (ABI 3730). (2) Análise das sequências obtidas através de comparação com a sequência de referência do DNA mitocondrial. Análise da qualidade e adequação de amostras de DNA obtidas de saliva para a detecção das mutações associadas a NOHL: Esta avaliação será realizada pela eletroforese em gel de agarose, análise da pureza e concentração por espectrofotometria. Eficiência na amplificação das regiões de interesse e resultado do sequenciamento. Comparação dos resultados do sequenciamento (presença da mutação e heteroplasmia) em amostras de sangue e saliva, obtidos de um mesmo paciente. Esta análise será realizada em pacientes e familiares já estudados previamente pelo grupo e que já tem o genótipo determinado. Com esta parte do projeto, avaliaremos se a detecção em DNA obtido de saliva poderia ser utilizada com segurança para a detecção em pacientes no lugar das amostras obtidas do sangue. Há estudos que utilizam e validam a utilização de amostras de DNA de saliva (Harini et al, 2016; Rogers et al, 2017), mas no caso de doenças mitocondriais devemos considerar que a presença e nível de heteroplasmia, que podem variar dependendo do tipo de células avaliadas (de Laat et al, 2012), o que pode comprometer a sensibilidade para o diagnóstico. As mutações associadas à NOHL geralmente apresentam-se em homoplasmia, mas não temos estudos avaliando a confiabilidade da análise da saliva para o diagnóstico desta doença.