Efeito de mutações no gene aire induzidas in vivo no timo por CRISPR-Cas9 no splicing alternativo de mRNAs que codificam antígenos de tecidos periféricos em células mTEC

• Processo: 21/02459-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Eduardo Antônio Donadi
• Beneficiário: Adriana Arruda Matos
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/10780-4 - Efeito de mutações no gene AIRE (síndrome APS1) induzidas por CRISPR-Cas9 na conformação da proteína, no transcriptoma de células mTEC e na sua interação com timócitos, AP.TEM
• Assunto(s): Imunogenética Mutação Timo Antígenos Células epiteliais CRISPR-Cas9 Processamento alternativo
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: células mTEC | CRISPR-Cas9 | Gene Aire | processamento alternativo | Timo | Imunogenética Molecular

Resumo

O (a) bolsista estudará o efeito de determinadas mutações no gene Aire associadas com a Síndrome APS1, sobre um dos processos moleculares essenciais das células mTEC que é o processamento alternativo (alternative splicing) de mRNAs que codificam PTAs. Na realidade já foi observado que o gene Aire controla o processamento alternativo estudando células mTEC CD80high e CD80low mas até o momento não se sabe se mutações nesse gene afetariam esse processo. Será feita a seleção das mutações do gene Aire humano (domínios SAND e PHD) para desenhar os componentes do sistema CRISPR-Cas9, seguindo as transfecções in vivo no timo de camundongos e posterior separação de células mTEC e caracterização das mutações no gene Aire. Preparações de RNA total de células mTEC wt (a partir de timos não manipulados) e Aire mutantes (a partir de timos transfectados com os elementos do sistema CRISPR-Cas9) serão utilizadas no sequenciamento do transcriptoma (RNA-Seq) e os dados serão analisados por meio de programas de bioinformática especializados, cujo pipeline para análise de grupos de mRNAs segundo as suas funções biológicas e também de isoformas de mRNAs oriundas do processamento alternativo, já está em uso em nossos laboratórios. Serão construídos mapas de expressão diferencial de mRNAs e de isoformas com agrupamento hierárquico (heat-map/hierarchical clustering) comparando células wt com Aire mutantes. Como o processamento alternativo aumenta a diversidade de TSAs, a identificação dos mRNAs que codificam os respectivos TSAs (mRNAs diferencialmente expressos), permitirá avaliar o efeito das mutações de Aire na expressão gênica promíscua e consequentemente na representação do próprio pelas células mTEC, processo essencial para a indução de tolerância imunológica. (AU)