Precipitação de fosfato de cálcio através de vesículas de matriz: compreensão de mecanismos de escala atômica através de estudos biomiméticos e RMN de estado sólido multinuclear

• Processo: 20/02026-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2022
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Antonio José da Costa Filho
• Beneficiário: Bruno Zoccaratto Favarin
• Supervisor: Thierry Azais
• Instituição Sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Université Paris-Sorbonne (Paris 4), França
• Vinculado à bolsa: 18/12092-0 - Estudos Biofísicos da Correlação Estrutura-função da Enzima TNAP em interação com modelos de membranas, BP.PD
• Assunto(s): Cinética Fosfatase alcalina Fosfatos de cálcio Membranas Proteolipossomos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cinética | fosfatase alcalina | membranas | proteolipossomos | Biofísica

Resumo

As fosfatases alcalinas são uma classe de enzimas que catalisam a hidrólise de fosfomonoésteres, produzindo fosfato. Em humanos, quatro fosfatases alcalinas foram identificadas até o momento. Nos mamíferos, essa enzima pode estar associada a distúrbios genéticos que levam a diferentes níveis de falha óssea e mineralização patológica dos vasos sanguíneos. Devido à sua relevância biológica, a fosfatase alcalina inespecífica dos tecidos (TNAP) atraiu a atenção em diferentes campos, desde a pesquisa fundamental - e a biofísica molecular em particular - à saúde pública. No entanto, apesar de sua importância vital, o mecanismo detalhado do TNAP durante a mineralização óssea ainda não é conhecido. Nesse contexto, propomos um projeto inovador baseado em três tarefas complementares. (I) Primeiro, propomos o projeto de modelos biomiméticos de vesículas da matriz nativa onde o TNAP é encapsulado em lipossomas. O efeito da composição lipídica, utilizando proteolipossomos como modelos de membrana celular, no mecanismo de ancoragem do TNAP e na atividade catalítica do TNAP será investigado. (II) Segundo, para avançar na compreensão do mecanismo de ação de mineralização do TNAP na escala atômica, serão realizadas experiências avançadas de ressonância magnética nuclear de estado sólido (1H, 31P, 43Ca) para caracterizar as fases de fosfato de cálcio precipitadas após hidrólise de substratos fosforilados. (III) Finalmente, o processo de mineralização de nossos modelos biomiméticos será comparado às vesículas da matriz nativa (MVs) extraídas de osteoblastos e condrócitos. Nossa abordagem é um primeiro passo essencial no estudo de mutações enzimáticas associadas a doenças, como as encontradas na hipofosfatase que poderiam ser mais investigadas em vesículas de membrana que imitam o ambiente biológico da enzima in vivo. As tarefas (I) e (II) serão desenvolvidas no laboratório "Química da Matéria Condensada de Paris" (LCMCP) na Sorbonne Université, Paris, sob a supervisão do Dr. Thierry Azaïs. Primeiro, para imitar o processo de biomineralização, serão preparados proteolipossomos contendo mutantes da fosfatase alcalina e, segundo, sua capacidade de precipitar fosfatos de cálcio, dependendo da composição das membranas, será investigada por experimentos avançados de ssNMR multidimensionais (1H-31P e 1H-13C HetCor, 13C-31P REDOR&) para revelar a interface organo-mineral subjacente ao processo de mineralização induzido pelo TNAP. Paralelamente, a morfologia dos proteolipossomos será investigada por microscopia eletrônica de transmissão em modo criogênico (Cryo-TEM), a fim de preservar sua hidratação nativa. A dinâmica dos proteolipossomos também será estudada por RMN de estado líquido. Finalmente, o uso da polarização nuclear dinâmica (DNP), uma nova abordagem que permite um aumento dramático do sinal de RMN (por várias ordens de magnitude), tanto no estado sólido (DNP MAS) quanto no estado líquido (D-DNP), será considerado. A tarefa (III), isto é, o isolamento de MVs de osteoblastos e condrócitos de embriões de galinha, será realizada na Université Lyon 1, sob a supervisão do Dr. Rene Buchet e Dra. Saida Mebark, e na Universidade de Roma Tor Vergata, sob a supervisão do Dr. Massimo Bottini. O projeto original está vinculado ao design de vesículas artificiais para regular sua composição e propriedades físicas, a fim de investigar separadamente a influência e a importância de cada parâmetro na formação de minerais. Além disso, os resultados obtidos com proteolipossomos serão comparados aos encontrados com VMs naturais para determinar condições que possam levar ao melhor biomaterial para fins de regeneração óssea, ajudando-nos a resolver problemas anômalos/patológicos de calcificação. (AU)