Estudo dos efeitos de mutações nos genes de Histoplasma capsulatum, gerados por CRISPR-Cas9, na sobrevivência e replicação intracelular de leveduras

• Processo: 21/01904-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2021
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos
• Pesquisador responsável: Carlos Pelleschi Taborda
• Beneficiário: Jéssica Luana Chechi
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Micologia médica Histoplasmose Histoplasma Mutação CRISPR-Cas9 Terapêutica Virulência Leveduras
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Histoplasmose | micose | Mutação gênica | terapêutica | Virulência | Micologia Médica

Resumo

Histoplasmose é uma infecção causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, sendo uma das micoses sistêmicas e endêmicas mais importantes com ampla distribuição mundial, com áreas de predominância nas Américas. Histoplasma é encontrado principalmente em solos contaminados com excrementos de certas espécies de aves ou guano de morcegos; consequentemente, a infecção por este patógeno normalmente ocorre após a exposição a estes ambientes contaminados. Histoplasma spp. é um patógeno intracelular, as leveduras são altamente adaptadas ao hospedeiro, utilizando macrófagos como um nicho proliferativo enquanto evita os mecanismos microbicidas no interior destas células. Como resultado, as células imunes inatas são incapazes de controlar H. capsulatum por conta própria. Durante infecção de H. capsulatum em macrófagos murinos, foi observada a expressão de um gene que codifica uma proteína coativadora, proteína de 100 KDa (Hc100p); esta proteína parece desempenhar função importante nos mecanismos de adaptação e sobrevivência deste fungo nas condições hostis no interior dos macrófagos. No entanto, até o momento a caracterização e função desta proteína são desconhecidos. Ainda, dentro do compartimento intracelular, a replicação das leveduras de Histoplasma requer a aquisição de vários nutrientes essenciais, incluindo íons metálicos. Estudos mostram que, embora o ferro e zinco são suficientemente abundantes em macrófagos em repouso, ativação de citocinas dos hospedeiros celulares causam restrição desses metais às leveduras como uma forma de imunidade nutricional. Desta forma, o objetivo desse estudo é elucidar e caracterizar, genes e proteínas envolvidos nos mecanismos de virulência, sobrevivência e replicação intracelular do patógeno fúngico Histoplasma capsulatum. Métodos: a cepa G217B de Histoplasma capsulatum será cultivada para obtenção de cepas mutantes usando o sistema de edição CRISPR-Cas9, para o gene que codifica para a proteína coativadora (Hcp100), assim como para aqueles que codificam para proteínas envolvidas na aquisição dos micronutrientes ferro e zinco. A sobrevivência e replicação das cepas mutantes e selvagens serão avaliadas em modelo in vitro usando macrófagos ativados por citocinas. Posteriormente, será realizada análise proteômica das leveduras selvagens e mutantes de H. capsulatum, provenientes de macrófagos ativados, para caracterização das proteínas e vias moleculares envolvidas na virulência, sobrevivência e replicação deste patógeno. Juntamente a estas análises, será avaliada a sobrevivência e replicação das cepas mutantes obtidas de H. capsulatum em modelo in vivo de Histoplasmose Pulmonar, bem como a análise de produção de citocinas pró e anti-inflamatórias nos pulmões de camundongos infectados. (AU)