Caracterização Bioquímica da Interação NHE3-dipeptidil peptidase 4 em túbulo proximal renal

• Processo: 22/14554-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2022
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Adriana Castello Costa Girardi
• Beneficiário: Márcia Bonini Galo
• Instituição Sede: Instituto do Coração Professor Euryclides de Jesus Zerbini (INCOR). Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP (HCFMUSP). Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/14534-3 - Efeitos pleiotrópicos de agentes antidiabéticos e de seus alvos farmacológicos: mecanismos renoprotetores para além do controle glicêmico, AP.TEM
• Assunto(s): Dipeptidil peptidase 4 Interação proteína-proteína NHE3 Túbulos renais proximais Bioquímica de proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: dipeptidil peptidase 4 | Interação proteína-proteína | Nhe3 | Túbulo proximal | Bioquímica de Proteínas

Resumo

Interações do tipo proteína-proteína são intrínsecas a via de regra todos os processos celulares. As proteínas de membrana com função de transporte iônico são direcionadas e inseridas em domínios celulares específicos por uma elaborada série de mecanismos. Demonstramos previamente que o NHE3 e a dipeptidil peptidase 4 (DPP4) se encontram associados fisicamente na membrana apical do túbulo proximal renal. Por meio da geração de proteínas de fusão e ensaios de pull-down identificamos que a região correspondente aos 131 aminoácidos C-terminais do NHE3 (aminoácidos 702-831) é essencial e suficiente para a formação do complexo com a DPP4. Posteriormente, por meio de ensaios de "overlay", observamos que a interação entre o NHE3 e a DPP4 é indireta, ou seja, requer a participação de proteínas acessórias. Este projeto visa identificar proteínas que fazem parte do complexo NHE3-DPP4 em túbulo proximal renal. As proteínas que medeiam a interação NHE3-DPP4 serão identificadas por cromatografia de afinidade. A proteína de fusão contendo o domínio do NHE3 (GST-fpNHE3-702-831) que interage com a DPP4 será imobilizada em coluna Affi-Gel. A anticorpo monoclonal contra DPP4 de rato será acoplado covalentemente em coluna contendo proteína G imobilizada. Em seguida, extrato de proteínas de membrana apical de túbulo proximal renal serão passadas através de cada uma destas colunas. Os antígenos que se ligarem a estas colunas serão eluídos, submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida e visualizados por coloração do gel com Coomassie. As proteínas isoladas serão cortadas do gel e digeridas com tripsina. Os peptídeos resultantes serão analisados por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS). Ensaios de imunoprecitação e de "pull-down" serão realizados para confirmar que as proteínas identificadas pelos procedimentos descritos acima realmente se associam fisicamente com o NHE3 e a DPP4. Estudos subsequentes serão delineados para avaliar a relevância fisiológica da associação física entre as proteínas identificadas.