O complexo Imidazol Glicerol Fosfato Sintase da bactéria termófila Thermotoga maritima: cinética de dimerização e termodinâmica da termoestabilidade

• Processo: 25/11314-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2030
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Sandro Roberto Marana
• Beneficiário: Livia Ranieri Esteves dos Santos
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/10577-0 - Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos (CEPID B3), AP.CEPID
• Assunto(s): Estabilidade térmica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Dímero | estrutura quaternária | termoestabilidade | Estabilidade térmica

Resumo

O complexo Imidazol Glicerol Fosfato Sintase (IGPS), formado pelas enzimas HisF e HisH, é parte da via de síntese de Histidina e purinas em bactérias. Na termófila Thermotoga maritima, este complexo (PDB 1GPW; UniProt Q9X0C8 e Q9X0C6 para HisF e HisH, respectivamente) exibe uma interface de dimerização com cerca de 1110 Å2, combinando 37 resíduos de HisF e 27 de HisH. Interessantemente, a atividade catalítica deste complexo envolve uma comunicação alostérica entre os dois sítios ativos, que depende de alterações conformacionais que se propagam através da interface de dimerização. Outra característica notável do complexo IGPS é a termoestabilidade, sendo que, por exemplo, a enzima HisF isolada tem uma temperatura de desnaturação (Tm) acima de 95°C.Deste modo, o complexo IGPS é um modelo apropriado para estudo de propriedades fundamentais de enzimas, como a estabilidade térmica e interações proteína-proteína.Abordagem 1A ligação reversível entre HisF e HisH para formação do complexo IGPS é geralmente estudada assumindo um equilíbrio simples envolvendo dois corpos rígidos (cada uma das enzimas). Por outro lado, é sabido que mudanças conformacionais são essenciais para a comunicação alostérica entre os sítios ativos destas enzimas. Este contraste sugere que a perspectiva de um simples equilíbrio de dimerização pode ser uma simplificação excessiva. Assim, o objetivo desta primeira abordagem é analisar a ligação entre HisF e HisH empregando um modelo de dois equilíbrios combinando, em qualquer ordem, etapa reversíveis de ligação e alteração conformacional.Abordagem 2Conforme mencionado, a enzima HisF selvagem tem uma Tm acima de 95°C. Por outro lado, uma HisF mutante contendo a substituição Y182A (PDB 6VDG) é muito menos termoestável, apresentando uma Tm de 84°C. Experimentos de dinâmica molecular computacional e NMR HSQC indicaram que a 70°C a mutante Y182A está enovelada, porém exibe alta proporção de movimentos desconcertados entre pares de seus resíduos, enquanto nesta mesma temperatura a HisF selvagem está enriquecida em movimentos correlacionados. Deste modo, a substituição Y182A parece ter promovido uma alteração na distribuição de calor pela estrutura de HisF, deixando a enzima mutante próxima da desnaturação. Neste contexto, nesta alta temperatura, embora ambas enzimas estejam enoveladas, a HisF mutante possivelmente visita uma conformação mais aberta, onde seus resíduos, mesmo do interior da estrutura, estão mais expostos ao solvente.Assim, o objetivo desta abordagem 2 é avaliar o grau de exposição ao solvente dos resíduos da HisF selvagem e mutante Y182A através de medidas de taxa de troca H/D em experimentos de 15N - 1H TROSY-2D NMR. (AU)