Expressão e caracterização de mutantes de triptofanos da Ca2+ATPase de retículo sarcoplasmático

• Processo: 99/07509-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 1999
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2001
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Sergio Verjovski Almeida
• Beneficiário: Rodrigo Louro
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 95/09467-9 - Estrutura e função de ATPases, AP.TEM
• Assunto(s): ATPases transportadoras de cálcio Fluorescência Mutação Triptofano Retículo sarcoplasmático
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Ca+2 Atpase | Expressao Heterologa | Fluorescencia | Mutacao Pontual | Purificacao Por Afinidade

Resumo

A Ca2+-ATPase é uma proteína que transporta Ca2+ do citoplasma para o interior do retículo sarco-endoplasmático, à custa de energia (ATP). A Ca2+-ATPase possui uma fluorescência natural característica. Essa fluorescência natural observada em proteínas deve-se à existência de fluoróforos intrínsecos, principalmente resíduos de triptofano e também de tirosina presentes na cadeia polipeptídica. A Ca2+- ATPase de retículo sarcoplasmático de coelho contém 13 resíduos triptofanilos. O trabalho em desenvolvimento tem como objetivo caracterizar o efeito de mutações pontuais em três desses resíduos triptofanilos (Trp 107, Trp 552 e Trp 794) presentes na cadeia polipeptídica da SR Ca2+-ATPase sobre o padrão de variação da fluorescência intrínseca da enzima observado durante a ligação de cálcio. Esses mutantes já foram construídos em uma etapa anterior do trabalho. O efeito de cada mutação sobre a estabilidade da Ca2+ ATPasel recombinante expressa em levedura será determinado por "Western blot" de lisados. A proteína mutante será purificada e assim utilizada para a obtenção de medidas da atividade ATPásica e medidas de/alterações no padrão de fluorescência intrínseca através de técnicas espectroscópicas. (AU)