Fator regulador de nhe3 (nherf): clonagem da proteina de celulas okp e analise das celulas com supressao da expressao de nherf.

• Processo: 04/03521-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2004
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2007
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Fisiologia
• Pesquisador responsável: Nancy Amaral Reboucas
• Beneficiário: Priscila Rocha Yanai
• Instituição Sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 99/12866-3 - Estudo molecular e funcional de transportadores de íons em membranas, AP.TEM
• Assunto(s): NHE3
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: H+Secretion | Nherf | Nhe3 | Okp | Proximal Tubule | Pth

Resumo

Células OKP, uma linhagem estável proveniente de túbulos proximais de opossum (Didelphis marsupialis), tem sido uma das linhagens celulares mais utilizadas para o estudo dos mecanismos de regulação funcional e genética de transprotadores presentes em túbulos proximais, especialmente os relacionados com a homeostase ácido-base e de cálcio/fósforo. Para o estudo da isoforma 3 do permutador Na+/H+ (NHE3) estas células são convenientes porque expressam apenas esta isforma do permutador. Além disso, expressa uma série de outras proteínas importantes para modulação funcional de NHE3, entre elas a isforma 1 do fator regulador de NHE3 (NHERF1), essencial para a fosforilação de NHE3 por proteína quinase A (PKA). NHERF tem dois dómícios PDZ e um domínio ERM que resulta em interação com proteínas modulatórias de canais iônicos (K+ e CI-), outros transportadores (Na+/HCO3-; Na+/Pi) e também com todas as 3 isformas de fosfolipase C (PLC). O objetivo do projeto proposto é clonar NHERF1 de OKP, utilizando uma abordagem por homologia (PCR com primers degenrados) seguida de RACE, e desenvolver uma célula knockdown de NHERF, com a utilização de siRNA. Após seleção dos transfectantes estáveis, iremos avaliar funcionalmente a célula no que se refere a regulação do pHi, controle do promotor de NHE3 em resposta a PTH, controle funcional de NHE3 em resposta a PTH, e medidas de [Ca2+]i, AMPc e IP3 em resposta a PTH. (AU)