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Fator regulador de nhe3 (nherf): clonagem da proteina de celulas okp e analise das celulas com supressao da expressao de nherf.

Processo: 04/03521-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de junho de 2004
Vigência (Término): 31 de maio de 2007
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Fisiologia
Pesquisador responsável:Nancy Amaral Reboucas
Beneficiário:Priscila Rocha Yanai
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:99/12866-3 - Estudo molecular e funcional de transportadores de íons em membranas, AP.TEM

Resumo

Células OKP, uma linhagem estável proveniente de túbulos proximais de opossum (Didelphis marsupialis), tem sido uma das linhagens celulares mais utilizadas para o estudo dos mecanismos de regulação funcional e genética de transprotadores presentes em túbulos proximais, especialmente os relacionados com a homeostase ácido-base e de cálcio/fósforo. Para o estudo da isoforma 3 do permutador Na+/H+ (NHE3) estas células são convenientes porque expressam apenas esta isforma do permutador. Além disso, expressa uma série de outras proteínas importantes para modulação funcional de NHE3, entre elas a isforma 1 do fator regulador de NHE3 (NHERF1), essencial para a fosforilação de NHE3 por proteína quinase A (PKA). NHERF tem dois dómícios PDZ e um domínio ERM que resulta em interação com proteínas modulatórias de canais iônicos (K+ e CI-), outros transportadores (Na+/HCO3-; Na+/Pi) e também com todas as 3 isformas de fosfolipase C (PLC). O objetivo do projeto proposto é clonar NHERF1 de OKP, utilizando uma abordagem por homologia (PCR com primers degenrados) seguida de RACE, e desenvolver uma célula knockdown de NHERF, com a utilização de siRNA. Após seleção dos transfectantes estáveis, iremos avaliar funcionalmente a célula no que se refere a regulação do pHi, controle do promotor de NHE3 em resposta a PTH, controle funcional de NHE3 em resposta a PTH, e medidas de [Ca2+]i, AMPc e IP3 em resposta a PTH. (AU)

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