Estudo da influencia dos aminoacidos eletricamente carregados da superficie de uma lisozima sobre suas propriedades cataliticas.

• Processo: 08/52059-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2008
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2009
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Enzimologia
• Pesquisador responsável: Sandro Roberto Marana
• Beneficiário: Nadia Michtchenko Henriques
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Enzimas Muramidase
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Afinidade Pelo Substrato | Cargas Superficiais | Enzimas | Lisozima | Ph Otimo

Resumo

As lisozimas digestivas possuem propriedades catalíticas particulares, como a redução da afinidade pelo substrato devido ao aumento de força iônica e um pH ótimo ácido. A comparação entre a lisozima digestiva de mosca MdL1 e a lisozima de ovo de galinha (HEWL) mostra estruturas terciárias muito similares e conservação nos resíduos do sítio ativo que ligam o substrato, além de evidenciar que as diferenças nos microambientes dos resíduos catalíticos não são suficientes para justificar a diferença de pH ótimo entre estas enzimas. Estes resultados sugerem que outros fatores, provavelmente resíduos externos ao sítio ativo, devam estar relacionados com as particularidades catalíticas das lisozimas digestivas. De fato, uma análise comparativa das superfícies de MdL1 e HEWL mostra ampla diferença na distribuição de resíduos de aminoácidos eletricamente carregados. HEWL é rica em resíduos positivamente carregados (17 aminoácidos básicos para 5 ácidos), enquanto MdL1 possui uma proporção de cargas mais balanceada (9 básicos para 6 ácidos). É possível que as cargas superficiais destas lisozimas afetem a ligação da cápsula bacteriana, que é negativamente carregada. O menor número de cargas positivas justificaria a maior sensibilidade de MdL1 a aumentos da força iônica, pois os íons blindariam as cargas e reduziriam a interação eletrostática entre enzima e substrato. A presença de cargas negativas em quantidade semelhante às positivas poderia resultar em repulsão eletrostática entre a enzima e o substrato em pHs próximos a neutralidade e alcalinos, confinando a formação de complexos ES à faixa ácida e justificando assim o pH ótimo de MdL1. Assim, para testar esta hipótese propomos a construção de MdL1 mutantes (simples: E11Q, D79N, D84N, R36A e K109A; triplo: E11Q-D79N-D84N) onde resíduos carregados superficiais sejam substituídos por resíduos sem carga. Estes mutantes serão expressos como proteínas recombinantes em Pichia pastoris e sua afinidade pela cápsula bacteriana avaliada em experimentos de cinética enzimática. (AU)