Isolamento e caracterização funcional de uma fosfolipase A2 ácida do veneno de Bothrops atrox

• Processo: 09/07801-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2009
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2010
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Farmácia - Análise Toxicológica
• Pesquisador responsável: Suely Vilela
• Beneficiário: Ithana Araujo
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 05/54855-0 - Toxinas animais: estrutura, função e aplicações biotecnológicas, AP.TEM
• Assunto(s): Venenos de serpentes Bothrops Fosfolipases A2 Caracterização
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bothrops atrox | Caracterização Funcional | Fosfolipase A2 | Inflamação e Atividade Antitumoral | Miotóxica | venenos de serpentes | isolamento e caracterização de toxinas animais

Resumo

Fosfolipases A2 (PLA2s; E.C.3.1.1.4) são enzimas, que catalisam especificamente a hidrólise de fosfolipídios na ligação éster do carbono 2, liberando lisofosfolipídios e ácidos graxos, em uma reação dependente de cálcio. Essas enzimas possuem uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como mionecrótico, anticoagulante, inibição de agregação plaquetária, neurotoxicidade, hipotensão arterial e indução de edema. Objetivo: o presente trabalho tem como objetivo o isolamento e caracterização funcional de uma fosfolipase A2 ácida do veneno de Bothrops atrox. Justificativa: até o momento, as fosfolipases A2 isoladas e caracterizadas do veneno de Bothrops atrox foram uma miotoxina com atividade fosfolipásica e anticoagulante (Lomonte et al., 1990), a BaPLA2I e a BaPLA2III, básica e neutra respectivamente (Kanashiro et al., 2002) e a miotoxina I, uma PLA2 Lys49 (Núñez et al., 2004). É necessária a realização de mais trabalhos para que os componentes do veneno desta espécie de serpente sejam melhores estudados. Estes estudos podem resultar na obtenção de informações relevantes sobre as atividades biológicas dessa proteína, assim como poderia ser utilizada como modelos de futuros fármacos aplicados à clínica médica. Portanto, o presente trabalho visa contribuir para a elucidação e determinação da composição bioquímica dos venenos animais. Materiais e métodos: veneno - Veneno bruto liofilizado de Bothrops atrox será adquirido do SANMARU LTDA (Registro junto ao IBAMA n. 182238). Casuística: para avaliação dos efeitos sobre plaquetas serão coletadas amostras de sangue (15 mL) de 2 voluntários adultos de ambos os sexos, após a devida aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP). O sangue será colhido por punção venosa na veia cubital do braço em tubos para coleta a vácuo após jejum de 8 horas, sendo que os riscos deste procedimento para os pacientes são jejum de 8 horas, sendo que os riscos deste procedimento para os pacientes são mínimos. Os materiais são descartáveis, não havendo riscos de contaminação. Animais: para experimentos de avaliação da atividade miotóxica e edematogênica serão utilizados 50 camundongos Swiss, machos pesando de 18 a 22g, fornecidos pelo Biotério da FCFRP-USP. Serão realizadas injeções intra-musculares (ativ miotóxica) e sub-plantar (ativ. Edematogênica), sendo os animais, ao fim do experimento, eutanasiados em câmera de gás contendo CO2 na presença do pesquisador responsável. Aspectos éticos: o projeto de pesquisa foi submetido ao CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais - e também ao CONEP - Comite de Ética em Pesquisa dos Seres Humanos da FCF para utilização de plasma humano fornecido pelo Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto, aguardando aprovação. Metodologia: o isolamento dessa enzima será realizado em três etapas cromatográficas (troca iônica, exclusão molecular e hidrofobicidade). A caracterização bioquímica dessa enzima será determinada por testes de determinação do peso molecular, ponto isoelétrico, quantificação de proteínas e sequenciamento N-terminal. A caracterização enzimática se dará por meio da atividade fosfolipásica dose-dependente e efeitos da temperatura e pH sobre essa atividade. A caracterização funcional será feita através das atividades anticoagulante, miotóxica e indução de edema. Efeito bactericida, atividade antitumoral e efeitos sobre plaquetas também serão verificados. (AU)