Interação do quimioatraente KM+ com componentes da matriz extracelular

• Processo: 96/07161-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 1996
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2001
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunoquímica
• Pesquisador responsável: Maria Cristina Roque Antunes Barreira
• Beneficiário: Luciane Ganiko
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Assunto(s): Matriz extracelular Neutrófilos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Glicoconjugado | Haptotaxia | Lectina | Matriz Extracelular | Migracao De Neutrofilos

Resumo

A lectina KM+ ligante de D-manose, extraída de sementes de jaca (Artocarpus integrifolia), é uma molécula tetramétrica formada pela associação não-covalente de cadeias glicopeptídicas de 16 kDa; sendo que cada cadeia apresenta um domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) (ROSA et al., 1999). KM+ tem a capacidade de induzir migração de neutrófilos in vitro e in vivo. Através de ensaios in vitro demonstrou-se que o mecanismo pelo qual a lectina induz migração de neutrófilos é haptotático. Estes CRDs estão diretamente envolvidos na atividade indutora de migração de neutrófilos, já que ela é inibida por D-manose (SANTOS-DE-OLIVEIRA et al., 1994). Demonstramos recentemente que pelo menos dois sítios de reconhecimento de manose estão envolvidos na indução de migração de neutrófilos, onde um deles é responsável pela interação com componente glicolisado da superfície do neutrófilo e outro, com glicoconjugado do tecido perivascular, promovendo assim a migração de neutrófilos através de mecanismo haptotático. Um número crescente de trabalhos vem sugerindo que os glicosaminoglicanos (cadeias que heparam sulfato de proteoglicanos do endotélio e da matriz subendotelial) correspondam a ligantes teciduais que viabilizariam a formação de um gradiente haptotático de quimiocina (TANAKA et al., 1993a; TANAKA et al., 1993b; WEBB et al., 1993; GILAT et al., 1994; LUSTER et al., 1995). Esse gradiente seria responsável pelo direcionamento da migração dos leucócitos após a diapedese. Para a lectina KM+, o seu ligante na matriz não é o proteoglicano de heparam sulfato, como foi sugerido para as quimiocinas, mas sim um componente glicosilado contendo resíduos de manose. Tal constatação se baseou na demonstração de que a pré-incubação de KM+ com D-manose, inibe completamente a sua ligação a seções de pele, enquanto a pré-incubação com heparam sulfato não tem efeito inibitório sobre a ligação. Ao contrário, heparam sulfato foi capaz de potencializar a ligação de KM+ às estruturas teciduais com as quais ela interage. Esses resultados nos indicam que (1) os sítios que reconhecem manose são fundamentais para que a molécula de KM+ induza a migração de neutrófilos por mecanismos haptotático; um dos sítios da molécula de KM+ interage com uma glicoproteína da superfície do neutrófilo, e outro com componente glicosilado do tecido perivascular; (2) interação da KM+ com o glicosaminoglicano heparam sulfato do endotélio de vasos e da matriz subendotelial, contribui para a haptotaxia de neutrófilos, potencializando o efeito atraente da KM+ (GANIKO et al., 1998). Essas observações fundamentaram a hipótese de que a interação da KM+ com heparam sulfato seja viabilizada por um sítio diferente daquele que reconhece manose e que ela estabilize a ligação do atraente ao substrato glicosilado tecidual, para a formação do gradiente haptotático. Propusemo-nos a investigar tal suposição a partir das seguintes etapas de trabalho: 1) verificar se KM+ interage com heparina intacta ou fragmentos de heparina e se tal interação tem efeito sobre a migração de neutrófilos, uma vez que os glicosaminoglicanos heparam sulfato e heparina apresentam estrutura análoga; 2) identificar a estrutura do glicosaminoglicano heparam sulfato reconhecida pela lectina KM+. Nesse aspecto, as sequencias já conhecidas dos oligossacarídeos de heparina poderão auxiliar na elucidação da estrutura de heparam sulfato reconhecida por KM+; 3) purificar o ligante glicosilado de KM+ a partir de extratos teciduais (pulmão) através de cromatografia de afinidade em coluna de agarose-KM+; 4) caracterizar o ligante tecidual purificado através de SDS-PAGE, Western-blot e ensaios de ligação em microplacas; 5) identificar o sítio de reconhecimento de manose e o sítio envolvido na ligação a heparam sulfato da lectina KM+, através do uso de um painel de monoclonais anti-KM+ e de fragmentos de KM+ já sequenciados. (AU)