Otimização e utilização da técnica da PCR em tempo real quantitativa (qPCR) na detecção e quantificação de infecção ativa causada pelos betaherprsvírus em amostras de plasma de pacientes transplantados de células progenitoras hematopieticas (TCPH)

Autor(es)

Renato Souza Oliveira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2015-08-20

Membros da banca

Sandra Helena Alves Bonon; Celso Francisco Hernandes Granato; Magnun Nueldo Nunes dos Santos

• Orientador: Sandra Helena Alves Bonon

Resumo

Introdução: Os herpesvírus humanos são os maiores causadores de infecções em pacientes transplantados e em pacientes imunodeprimidos em geral. Altos níveis de HHV-6 estão associados com aumento da mortalidade e doença do enxerto contra o hospedeiro, doença pelo citomegalovírus humano e encefalites em transplantados de células progenitoras hematopoéticas. O HHV-7 pode causar febre e rash cutâneo e um possível cofator para a doença por HCMV. Atualmente, métodos moleculares de detecção e quantificação de agentes infecciosos estão sendo utilizados na rotina a fim de propiciar um tratamento precoce com antivirais adequados (terapia preemptiva), principalmente para o HCMV. A Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) é uma das modernas opções a ser utilizada no monitoramento dos pacientes transplantados. Uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de utilização do plasma de pacientes neutropênicos, onde esta situação frequentemente impossibilita a realização da antigenemia no sangue total. Assim o desenvolvimento de técnicas "in house" contribuem minimizando os altos gastos com kits comerciais. Objetivos: Otimizar e utilizar uma técnica de PCR em tempo real "in house" utilizando a tecnologia Taqman na detecção e quantificação de DNA dos betaherpesvírus estudados nos pacientes TCPH. Pacientes e métodos: O desenho dos primers foi realizado de regiões conservadas e especificas para os vírus. Foi realizada também a nested PCR e realizada uma a comparação entre estas técnicas. Foram obtidas de forma prospectiva, semanalmente, amostras de plasma de 60 pacientes TCPH, desde o dia do transplante até o dia +100 após o transplante. Os resultados obtidos foram comparados a um grupo controle pareados por sexo e idade e com pacientes transplantados de órgãos sólidos, no caso, pacientes transplantados cardíacos. Resultados: Dos 60 pacientes estudados, 30 foram do sexo masculino e 30 do feminino. Infecção ativa pelo HCMV, HHV-6 e HHV-7 detectada pela Nested-PCR no plasma ocorreu em 61,7%, 23,3% e 51,7%, com mediana de 34 dias (variação 2-91 dias), 24 dias (variação 1-96 dias) e 15 dias (variação 0-98 dias), respectivamente. Antigenemia positiva para HCMV em 48,3%, mediana 40 dias (variação 20-91 dias) após o transplante. A qPCR para HCMV, HHV-6 e HHV-7 ocorreu, respectivamente, em 70%, 16,7% e 41,7%, com medianas de 26, 20,5 e 20 dias. Em 5/37 (13,5%) pacientes com infecção ativa pelo HCMV foram a óbito em menos de 100 dias após o transplante (mediana 50 dias, variação 46-100 dias) e 2/5 (40%) tiveram como causa principal do óbito doença por HCMV. Quatorze com infecção ativa pelo HCMV (24,6%) apresentaram GVHD agudo e overlap. Em relação o número de células positivas pela antigenemia, a mediana encontrada foi de 31 células. Cinco pacientes (8,8%) apresentaram doença por HCMV no trato gastrointestinal (TGI), comprovados por biópsia. Infecção ativa pelo HHV-6 no plasma foi diagnosticada em 12/57 pacientes (21%), numa mediana de 24 dias após o transplante (variação 0-84 dias). Um paciente com HHV-6 positivo (8,3%) foi a óbito em menos de 100 dias após o transplante e teve coinfecção pelo HCMV, indo a óbito por este agente. Quatro pacientes com HHV-6 (33,3%) apresentaram GVHD agudo e overlap. HHV-7 ocorreu em 31/57 (54,3%) mediana 15 dias após o transplante (variação 0-98 dias). Em 3/31 pacientes com HHV-7 (9,7%) foram a óbito em menos de 100 dias após o transplante e tiveram como causa principal do óbito GVHD agudo e infecção bacteriana. Oito pacientes com HHV-7 (25,8%) apresentaram GVHD agudo e overlap. Conclusão: O diagnóstico rápido e precoce destas infecções poderá auxiliar na rotina diagnóstica e de tratamento dos pacientes que são foco deste estudo e de outros pacientes que poderão se beneficiar com nosso trabalho (AU)

• Processo FAPESP: 12/21851-6 - Padronização e Implantação da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real na monitorização da reativação precoce e terapia preemptiva de betaherpesvírus em pacientes transplantados de células progenitoras hematopoéticas
• Beneficiário: Renato Souza de Oliveira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado