Estudo do envolvimento das helices N- e C-terminais na estabilidade e na via de enovelamento de mioglobina

Autor(es)

Euripedes de Almeida Ribeiro Junior

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2004-03-17

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Carlos Francisco Sampaio Bonafé; Francisco Benedito Teixeira Pessine; Marcelo Matos Santoro; Shaker Chuck Farah

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

A mioglobina é uma hemeproteína que tem a função de transportar e armazenar o oxigênio. Suas estruturas primária e secundária são compostas por 153 aminoácidos e oito a-hélices (nomeadas de A-H), respectivamente. Esta proteína tem sido usada como um bom modelo para estudos de estrutura, função, ligação de heme, estabilidade e enovelamento de proteínas. Em condições ligeiramente ácidas (pH em torno de 4), a apomioglobina se desenovela passando por uma forma intermediária que possui propriedades físicas entre o estado nativo (pH 7) e o estado desenovelado (pH 2). Este intermediário apresenta as hélices A, G e H protegidas como demonstrado por experimentos de troca de deutério. No presente trabalho, foram realizados estudos com mutantes de deleção e de permutações circulares de hélices da mioglobina com a finalidade de aumentar o conhecimento sobre como a estrutura terciária de uma proteína é construída. Três classes de mutantes foram criadas: 1) deleção de hélices: 1.1) um mutante de deleção da hélice H (Mb1-123) e 1.2) um mutante de deleção das hélices G e H (Mb1-99); 2) permutações circulares: 2.1) um mutante de permutação da hélice A da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb-B_GHA) e 2.2) um mutante de permutação das hélices A e B da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb- C_GHAB) e 3) permutação com deleção: um mutante de deleção da hélice G com permutação da hélice H da extremidade C-terminal para N-terminal (Mb-HAB_F). As proteínas mutantes foram purificadas diretamente na forma apo, embora estes mutantes possuam capacidade de se ligar ao grupo heme, com exceção do mutante Mb1-123. Estes mutantes possuem valores mais baixos de elipticidade molar e tendência maior à agregação do que a proteína selvagem. Quando na forma holo, os dois mutantes circularmente permutados são compactos e têm estrutura e função semelhantes à holoMbWT. Este resultado difere do resultado observado para as variantes de deleção (Mb1-99 e Mb-HAB_F) que não apresentaram restabelecimento da estrutura e nem supressão da tendência à agregação. Nossos resultados indicam que, embora a mioglobina possua um núcleo de ligação do grupo heme, as hélices A, B, G e H são necessárias para a correta arquitetura da proteína. Apesar da menor estabilidade dos mutantes de permutação circulares em relação à proteína selvagem, as extremidades N- e Cterminais da mioglobina são necessárias para que a proteína alcance uma estrutura estável e funcional semelhante à selvagem. As permuteínas estruturaram a forma intermediária mesmo em pH ao redor de 7, mostrando novamente que as extremidades N- e C- terminais de mioglobina são necessárias para que elas se estruturem como a selvagem. Acreditamos que um núcleo, que se mostrou insensível ao novelamento em meio ácido, foi formado nestes mutantes. Como estes mutantes diferem quanto à posição da hélice B, eles permitiram inferir sobre a participação da hélice B no intermediário de ApoMbWT. Duas formas de intermediários estão provavelmente presentes na via de enovelamento da mioglobina e suas maiores diferenças parecem estar na quantidade de estrutura formada pela hélice B. Nossos resultados estão de acordo com o modelo seqüencial de enovelamento para mioglobina, no qual a hélice B é incorporada após a formação do domínio AGH (AU)

• Processo FAPESP: 99/09849-0 - Estudo do envolvimento das hélices N- e C-terminais na estabilidade e na via de enovelamento de mioglobina
• Beneficiário: Euripedes de Almeida Ribeiro Júnior
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado