Polímeros biomiméticos nanomagnéticos com acesso restrito (RAMIP magnéticos) obtidos por síntese semicovalente e não covalente visando aplicação em imunossensores e imunoensaios

Autor(es)

Rafael Rovatti Pupin

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Araraquara. 2017-08-29.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Química. Araraquara
• Data de defesa: 2017-08-04
• Orientador: Maria del Pilar Taboada Sotomayor; María Isabel Pividori

Resumo

A biotina (vitamina B7) pode ser acoplada a diferentes tipos de moléculas e, ainda assim, ser reconhecida seletivamente pelas proteínas avidina e estreptavidina devido à alta constante de afinidade que existe entre elas (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Assim, essa interação proporciona excelente aumento na sensibilidade de várias análises; o que leva ao desenvolvimento métodos analíticos para determinação de diferentes compostos que são biotinilados. O uso de materiais biológicos, como anticorpos ou proteínas, em análises de rotina se torna muitas vezes dispendioso e, devido à baixa estabilidade das biomoléculas em condições adversas às mesmas, iniciou-se a síntese de materiais que possam mimetizar as interações biológicas de reconhecimento; o que vem sendo feito com sucesso pelos polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses polímeros apresentam vantagens em relação às biomoléculas por possuirem baixo custo, fácil preparação e alta resistência mecânica e térmica. Assim, esta dissertação aborda a síntese, caracterização, otimização e aplicação de diferentes MIP que possuem biotina como molécula alvo. Os estudos iniciais focaram na síntese do MIP magnético (MMIP) com acesso restrito (RAMIP) para realizar exclusão proteica pela modificação do polímero com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG). Enquanto o RAMIP recoberto com BSA não apresentou bons resultados nos experimentos, o RAMIP recoberto com PEG, após otimização, apresentou resultados altamente satisfatórios na exclusão proteica (com valores na faixa de 98 até 99,4 % de exclusão) e bons resultados na religação da biotina (2,0 mg de biotina por grama de polímero). A segunda parte do trabalho foi focada no estudo da influência do tipo de impressão molecular (não covalente e semicovalente) na capacidade do reconhecimento seletivo dos MMIP. Para isso, foi sintetizado previamente o complexo analito-monômero (por meio de uma ligação covalente entre a biotina e o álcool alílico como monômero funcional). Esse MMIP foi submetido aos ensaios de reconhecimento da biotina utilizando-se interações não covalente, sendo denominado de MMIP semicovalente; cujos resultados foram comparados com MMIP para biotina não covalente otimizado previamente. O MMIP semicovalente apresentou uma constante de afinidade pela biotina de 5,9×104 L mol-1, enquanto para o MMIP não covalente foi de 2,4×103 L mol-1. Finalmente, o MIP e o MMIP para biotina (sintetizados via não covalente) foram aplicados em ensaios biomiméticos utilizando as técnicas de ELISA e Fluxo Lateral. Nos ensaios ELISA avaliou-se a capacidade de reconhecimento do MMIP pela biotina-HRP e DNA biotinilado (das bactérias E. coli e Salmonella). Para biotina-HRP, o MMIP apresentou retenção (na faixa de 5,0 até 2500 ng mL-1), e uma alta intensidade de sinal. Para o DNA biotinilado, de ambas bactérias, o MMIP mostrou maior retenção do amplicon quando comparado ao NIP. A aplicação do MIP nos dispositivos de Fluxo Lateral é inédita. Assim, após a otimização de todos os parâmetros para desenhar a linha de teste contendo MIP (como solvente, massa, soluções, etc.), avaliou-se a resposta do sistema para diferentes moléculas biotiniladas: para BSA-biotina e o corante Atto 655-biotina os resultados não foram satisfatórios; para biotina-HRP, biotina 4-fluoresceína e os amplicons, MIP apresentou boa resposta no reconhecimento seletivo. Assim, os MIP mostraram-se promissores no desenvolvimento de ensaios biomiméticos. (AU)

• Processo FAPESP: 15/04367-1 - Polímeros biomiméticos nanomagnéticos com acesso restrito (RAMIP magnéticos) obtidos por síntese semicovalente e não covalente visando aplicação em imunossensores e imunoensaios
• Beneficiário: Rafael Rovatti Pupin
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado