Co-imobilização das enzimas acetilcolinesterase e B-secretase1: estudo de condições para triagem de ligantes

Autor(es)

Adriana Ferreira Lopes Vilela

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2018-03-23

Membros da banca

Carmen Lúcia Cardoso; Vanderlan da Silva Bolzani; Quezia Bezerra Cass; Marcela Cristina de Moraes

• Orientador: Carmen Lúcia Cardoso

Resumo

As enzimas, acetilcolinesterase (AChE) e ?-secretase1 (BACE1), são alvos validados para o tratamento da Doença de Alzheimer (DA) uma vez que atuam no sistema nervoso central contribuindo para o avanço da doença. Neste contexto, o interesse por inibidores destas enzimas e a busca por ensaios enzimáticos seletivos e eficazes tem importância crucial. Neste trabalho é descrito o desenvolvimento de metodologias on-line, em capilares de sílica fundida, e off-line, em esferas de agarose para triagem de ligantes envolvendo as enzimas AChE e BACE1 via imobilização e co-imobilização por ligação covalente. Nos métodos on-line, a imobilização da BACE1 e a co-imobilização das enzimas AChE e BACE1 em capilares de sílica fundida foram realizadas via ligação amino-glutaraldeído e as atividades das enzimas foram monitoradas on-line por cromatografia líquida de alta de eficiência e espectrometria de massa (CLAE-EM) através da medida das massas correspondentes aos produtos das clivagens enzimáticas. Nestes, foram possíveis se determinar os parâmetros cinéticos para as enzimas imobilizadas como; variações de pH e temperatura, as constantes cinéticas (KMap) e validação com inibidores padrão. Ressaltando também a aplicação na triagem de uma coleção de oito compostos sintéticos com identificação de dois compostos e a caracterização dos mesmos. Nos métodos off-line, a imobilização da AChE e da BACE1 em suportes de agarose foram realizadas partindo de diferentes tipos de ligação com grupos nucleófilos previamente ligados ao suporte. Os diferentes suportes de agarose com a AChE imobilizada foram estudados usando o propionato de p-nitrofenil como substrato por meio da medida da absorbância do produto formado p-nitrofenol a 348 nm. O sistema com a enzima imobilizada agarose-trietilamina-AChE (agarose-TEA-AChE) ótimo foi utilizado para validação do método para triagem de ligantes com o inibidor padrão sendo determinado os parâmetros cinéticos e termodinâmicos de inibição, tais como; potência inibitória (IC50), constante de inibição (Ki) e constante de dissociação (KD). Já para a enzima BACE1, a atividade enzimática foi monitorada por fluorescência a ?em= 495 nm (?ex= 395 nm) utilizando o substrato IV, sendo possível a seleção do melhor método para imobilização da BACE1. Em ambos os métodos, on-line e off-line, a imobilização foi eficiente refletindo na atividade de cada enzima após o processo. Os métodos para triagem desenvolvidos neste trabalho são inéditos para ambas as enzimas e reportam grandes avanços comparados aos ensaios já consolidados, uma vez que a co-imobilização contribuiu para a construção de um modelo de triagem inovador, sendo possível a avaliação das interações específicas de um ligante contra dois alvos biológicos em um mesmo sistema (CLAE-EM) automatizado. Ressaltando também que os métodos com a AChE e BACE1 em duas matrizes distintas forneceram modelos de ensaios com formatos diferentes que podem ser aplicados de acordo com as ferramentas analíticas disponíveis, desde as mais simples como espectrofotometria no UV-Vis, fluorescência, aos mais sofisticados e automatizados como CLAE-EM. (AU)

• Processo FAPESP: 16/02873-0 - Acetilcolinesterase e beta-secretase 1: estudo de condições de co-imobilização para triagem de ligantes
• Beneficiário: Adriana Ferreira Lopes Vilela
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado