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Métodos LC-MS/2D para triagem de ligantes para a avaliação de atividade inibitória de enzimas e identificação dos compostos ativos em extratos brutos

Processo: 14/11640-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2014
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2017
Área do conhecimento:Ciências Exatas e da Terra - Química - Química Orgânica
Pesquisador responsável:Carmen Lúcia Cardoso
Beneficiário:Cláudia Seidl
Instituição-sede: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
Vinculado ao auxílio:13/01710-1 - Ligantes enzimáticos: novos modelos de triagem, AP.TEM
Bolsa(s) vinculada(s):16/02941-5 - Desenvolvimento e otimização de metodologias bidimensionais de cromatografia líquida acopladas a bioensaios para a descoberta de inibidores enzimáticos em extratos de produtos naturais, BE.EP.PD
Assunto(s):Produtos naturais   Cromatografia de afinidade   Enzimas   Extratos vegetais   Fármacos   Doença de Alzheimer

Resumo

A identificação de substâncias com atividade biológica em extratos naturais ou coleções sintéticas é uma etapa crucial e requer o uso de técnicas rápidas e eficientes de separação e de triagem. Esse paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem que facilitem e reduzam o tempo empregado na identificação dessas substâncias. Empregando-se técnicas cromatográficas, o isolamento de princípios ativos oriundos de um extrato natural raramente pode ser concretizado em uma única etapa cromatográfica. O emprego de métodos cromatográficos 2D é uma estratégia valiosa para se obter uma maior eficiência na separação com redução do tempo de análise. As separações 2D por cromatografia líquida já são bem estabelecidas e podem ser classificadas em abrangente, pseudo-abrangente e "heart-cutting". No modo abrangente (LCxLC) todo o efluente da primeira dimensão, ou parte representativa dele, é introduzida na segunda dimensão. Essa é a principal diferença quando comparada com a cromatografia liquida heart-cutting (LC-LC) na qual somente frações selecionadas são transferidas para a segunda coluna. Métodos clássicos de fracionamento de extratos naturais bioguiados envolvem alto consumo de tempo, enquanto que triagens off-line não resultam em informações sobre os compostos individuais e muitas vezes apresentam resultados falsos positivos ou falsos negativos. Uma alternativa promissora é o acoplamento das técnicas de separação cromatográfica, principalmente as multidimensionais com os ensaios biológicos, chamados de triagem de alta resolução. Dessa forma, é possível detectar a atividade biológica diretamente no eluente do LC e caracterizar quimicamente o(s) composto(s) biologicamente ativos on line, pelo MS, resultando em redução do tempo e trabalho despendidos na coleta das frações para posterior detecção de atividade. Para a realização dos ensaios biológicos on line, o emprego de enzimas imobilizadas é uma alternativa valiosa. As enzimas imobilizadas possuem maior estabilidade na presença de solventes orgânicos e variações de temperatura, além de permitir a reutilização e o uso de pequenas quantidades de enzima. Nesse contexto, a proposta desse projeto é o desenvolvimento de um método rápido on-line para identificação dos constituintes bioativos de extratos de plantas sem a necessidade de purificação prévia. O extrato é separado na primeira dimensão e as bandas cromatográficas são transferidas para o biorreator, onde a atividade inibitória é avaliada. ICERs (Immobilized capillary enzyme reactors) contendo as enzimas colinesterases acetilcolinesterase (AChE) e a butirilcolinesterase (BChE), foram desenvolvidos em nosso grupo de pesquisa e foram selecionadas como alvos enzimáticos modelo para esse projeto. Essas serinas hidrolases são responsáveis pela catálise da hidrólise do neurotransmissor, acetilcolina, durante as sinapses em terminações nervosas e são alvos de interesse nos estudos de desenvolvimento de fármacos para a Doença de Alzheimer. Além disso, por atuarem na transdução de sinais em animais, há um grande interesse na descoberta de inibidores dessas enzimas para serem utilizados na agricultura como pesticidas e contra insetos sociais. (AU)

Publicações científicas (6)
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
JULIANA M. LIMA; CLAUDIA SEIDL; ELISE M. F. CUNHA; ARTHUR H. C. OLIVEIRA; CARMEN L. CARDOSO. On-Flow Ligand Screening Assay Based on Immobilized Nucleoside Diphosphate Kinase B from Homo sapiens. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 30, n. 11, p. 2308-2317, Nov. 2019.
LIMA, JULIANA M.; SEIDL, CLAUDIA; CUNHA, ELISE M. F.; OLIVEIRA, ARTHUR H. C.; CARDOSO, CARMEN L. On-Flow Ligand Screening Assay Based on Immobilized Nucleoside Diphosphate Kinase B from Homo sapiens. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 30, n. 11, SI, p. 2308-2317, NOV 2019. Citações Web of Science: 0.
DE JESUS, RAPHAEL A.; PRADO, VILMA M. J.; PINTO, VANDERSON S.; SILVA, VALDENIZIA R.; SANTOS, LUCIANO S.; NOGUEIRA, PAULO C. L.; NAVICKIENE, SANDRO; PEREIRA-FILHO, EDENIR R.; BLANK, ARIE E.; BEZERRA, DANIEL P.; SOARES, MILENA B. P.; SEIDL, CLAUDIA; CARDOSO, CARMEN L.; MORAES, VALERIA R. S. Application of LC-DAD Metabolic Fingerprinting in Combination with PCA for Evaluation of Seasonality and Extraction Method on the Chemical Composition of Accessions from Lippia alba (Mill.) N. E. Brown and Biological Activities. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 30, n. 5, p. 978-987, MAY 2019. Citações Web of Science: 0.
RAPHAEL A. DE JESUS; VILMA M. J. PRADO; VANDERSON S. PINTO; VALDENIZIA R. SILVA; LUCIANO S. SANTOS; PAULO C. L. NOGUEIRA; SANDRO NAVICKIENE; EDENIR R. PEREIRA-FILHO; ARIE F. BLANK; DANIEL P. BEZERRA; MILENA B. P. SOARES; CLAUDIA SEIDL; CARMEN L. CARDOSO; VALÉRIA R. S. MORAES. Application of LC-DAD Metabolic Fingerprinting in Combination with PCA for Evaluation of Seasonality and Extraction Method on the Chemical Composition of Accessions from Lippia alba (Mill) N. E. Brown and Biological Activities. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 30, n. 5, p. 978-987, Maio 2019.
LOPES VILELA, ADRIANA FERREIRA; SEIDL, CLAUDIA; LIMA, JULIANA MARIA; CARDOSO, CARMEN LUCIA. An improved immobilized enzyme reactor-mass spectrometry-based label free assay for butyrylcholinesterase ligand screening. Analytical Biochemistry, v. 549, p. 53-57, MAY 15 2018. Citações Web of Science: 6.
MONTEIRO, AFIF F.; SEIDL, CLAUDIA; SEVERINO, VANESSA G. P.; CARDOSO, CARMEN LUIA; CASTRO-GAMBOA, IAN. Biotransformation of labdane and halimane diterpenoids by two filamentous fungi strains. ROYAL SOCIETY OPEN SCIENCE, v. 4, n. 11 NOV 2017. Citações Web of Science: 4.

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