Desenvolvimento e otimização de metodologias bidimensionais de cromatografia líquida acopladas a bioensaios para a descoberta de inibidores enzimáticos em extratos de produtos naturais

Resumo

A identificação de substâncias com atividade biológica em extratos naturais ou coleções de substâncias sintéticas é um passo crucial e requer a utilização de técnicas rápidas e eficientes para a separação e triagem. Este paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem para facilitar e reduzir o tempo necessário para identificar tais substâncias. Empregando técnicas de cromatografia, o isolamento de princípios ativos derivados de um extrato natural pode excepcionalmente ser conseguido num único passo cromatográfico. O uso de métodos cromatográficos bidimensionais (2D) é uma estratégia valiosa para se obter uma maior eficiência de separação. Métodos de separação clássicos de extratos naturais envolvem alto consumo de tempo, enquanto triagem offline não resultam em informações sobre compostos individuais e muitas vezes têm resultados falsos positivos ou falsos negativos. Uma alternativa promissora é o acoplamento de técnicas de separação cromatográfica, em particular as multi-dimensionais, com ensaios biológicos (isto é, elevado rendimento de rastreio). Assim, é possível detectar atividade biológica diretamente no efluente da cromatografia líquida e quimicamente caracterizar os compostos com atividade biológica on-line, utilizando espectrometria de massa (MS), resultando na redução do tempo e trabalho. Para a realização de ensaios biológicos on-line, o uso de enzimas imobilizadas é uma ótima opção. Neste contexto, o objetivo deste projeto é desenvolver um método rápido para a identificação on-line de componentes bioativos de extratos de plantas sem a necessidade de purificação prévia. Extratos de plantas, em primeiro lugar serão separados na primeira dimensão e os compostos são separados serão transferidos para o biorreator, onde a atividade biológica de cada composto ou um pequeno grupo de compostos será medida. ICERs (do inglês immobilized capillary enzyme reactors) que contêm a enzima acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE), foram desenvolvidos em nosso grupo de pesquisa e foram selecionados como alvos enzimáticos modelo para este projeto. Estas enzimas são hidrolases de serina responsáveis pela catálise da hidrólise do neurotransmissor acetilcolina nas terminações nervosas e nas sinapses. Estes são alvos de interesse em estudos do desenvolvimento de fármacos para a doença de Alzheimer. (AU)