Estrutura, conformação e inibição de quinases de Leishmania

Autor(es)

Plínio Salmazo Vieira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-05-08

Membros da banca

Mário Tyago Murakami; Richard John Ward; Gustavo Costa Bressan; Marcos Antonio de Oliveira; Juliana Helena Costa Smetana

• Orientador: Priscila Oliveira de Giuseppe; Mário Tyago Murakami

Resumo

Quinases são enzimas fundamentais em muitos aspectos do metabolismo, da regulação gênica e da transmissão de sinais na célula. Parasitas intracelulares unicelulares podem fazer uso dessas proteínas em diversas funções, como divisão, sinalização e em sua interação com o hospedeiro. Em especial, o parasita Leishmania, causador da leishmaniose em diversas partes do mundo, é de grande interesse. Neste contexto, o entendimento de proteínas que participam de suas vias metabólicas, muitas das quais as quinases estão envolvidas, pode trazer benefícios para o controle e erradicação da doença, onde o número de novos casos é de cerca de um milhão e meio de pessoas, colocando em risco outras trezentos e dez milhões. Neste trabalho, foram estudadas duas quinases: as NEK quinases e as Nucleosídeo Difosfato Quinases. As NEK quinases são Ser/Thr quinases com funções relacionadas primariamente à cílios e flagelos, com grande expansão em organismos que possuem estas estruturas ligadas à divisão celular, como é o caso da Leishmania. A análise filogenética e de domínios mostrou que muitas NEKs são exclusivas do parasita, enquanto outras são próximas do hospedeiro humano. Uma construção da NEK LbrM.21.1750, dentre 21 iniciais que foram testadas sob 210 condições de expressão, foi purificada de forma eficiente e em quantidades suficientes para estudos estruturais. Apesar dos esforços empregados na cristalização, a proteína mostrou-se recalcitrante a este processo, o que impediu a elucidação da estrutura a alta resolução. Entretanto, o envelope de baixa resolução gerado pelos dados de SAXS corroborou com a estrutura tridimensional gerada pela modelagem por homologia. Ensaios de DSF com a LbrM.21.1750 selecionaram três compostos análogos ao ATP, dos quais apenas um (NU6140) pôde ser utilizado nos experimentos de cinética devido às condições de sais empregadas, com a molécula sendo caracterizada como um inibidor competitivo. As três moléculas foram testadas in vitro em culturas de Leishmania braziliensis, sendo ativas sobre as formas promastigota e amastigota do parasita, com exceção da molécula PD153035, que possivelmente não penetrou a membrana do macrófago. Deste modo, foram identificadas três possíveis novas moléculas através da NEK quinase que podem ser utilizadas como modelos iniciais para o desenvolvimento de novas drogas. A outra proteína estudada, NDK, é importante na manutenção dos níveis intracelulares de NTPs e NDPs, entre outras funções inclusive extracelulares, já que foi encontrada como sendo secretada por espécies de Leishmania. A NDK de L. braziliensis e as formas mutantes P95S, 'delta'5Cterm e P100S-'delta'5Cterm da NDK de Leishmania major foram purificadas em grandes quantidades e cristalizadas, tendo sua estrutura tridimensional posteriormente resolvida. Os envelopes de SAXS mostraram que, com exceção da proteína mutante P100S-'delta'5Cterm que é um dímero, todas as outras são hexamérica. Através de um estudo estrutural comparativo entre as proteínas nativas de L. braziliensis e L. major e as formas mutantes da última, foi possível notar a importante influência da região C-terminal desta enzima, com impacto em sua correta oligomerização e, por consequência, em sua atividade total. Deste modo, demonstrou-se que a região possui potencial como alvo para inibição da enzima, já que altera não só sua estrutura quaternária, como também sua função. Coletivamente, os estudos de ambas proteínas fornecem novas informações a respeito do repertório de quinases destes parasitas e trazem potenciais estratégias para sua inibição e consequente desenvolvimento de novas terapias (AU)

• Processo FAPESP: 11/24178-8 - Estudos estruturais das NEK quinases de Leishmania braziliensis.
• Beneficiário: Plínio Salmazo Vieira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado