HIF-3alfa: estudos estruturais, identificação e caracterização de um inédito cofator celular dos fatores de transcrição induzíveis por hipóxia (HIF) e estudos estruturais das prolil-hidroxilases (PHDs) de organismos não usuais

Autor(es)

Angela Maria Fala

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2017-07-20

Membros da banca

Andre Luís Berteli Ambrosio; Daniela Barretto Barbosa Trivella; Daniel Maragno Trindade; Adriana Franco Paes Leme; Cristiane Rodrigues Guzzo Carvalho

• Orientador: Andre Luís Berteli Ambrosio

Resumo

HIFs (Hypoxia inducible factors) são fatores de transcrição multidomínio, formados pelo heterodímero entre as subunidades alfa e beta. São conhecidas três isoformas para a subunidade alfa (HIF-1alfa, HIF-2alfa e HIF-3alfa), sob condições de normóxia todas as isoformas alfa sofrem regulação pós traducional sendo reguladas por uma família de hidroxilases, as PHDs (Prolil hidroxilases), as quais hidroxilam dois resíduos de prolina presente no domínio ODDD (domínio dependente de oxigênio), e subsequente levando a poli ubiquitinação destinando as subunidades alfa para degradação via proteossomo. As PHDs são hidroxilases dependentes de oxigênio, das quais são conhecidas quatro isoformas, e todas são capazes de hidroxilar as subunidades alfa das HIF e são, portanto, seu principal regulador. O complexo HIF-alfa e HIF-beta podem regular a transcrição de mais de 100 genes, dos quais muitos estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer, como a regulação de genes envolvidos em angiogênese, eritropoiese, proliferação celular e apoptose. A HIF-3alfa foi a última isoforma a ser descoberta entre as subunidades ?, e ela é distinta de várias maneiras em comparação às demais. Primeiro, o gene de codificação para HIF-3alfa (HIF3A) é regulado pela HIF-1alfa e é exclusivamente sujeito a splicing alternativo, com seis isoformas confirmadas em níveis proteicos, das quais o único domínio comum entre todas elas é o domínio Per-ARNT-Sim (PASb), que é responsável pela heterodimerização com a HIF-beta. Além disso, a ausência completa do domínio C-terminal (CTAD) leva a isoforma a ser a menor entre as isoformas alfa. Dada a importância das HIFs na biologia e progressão do câncer os objetivos deste trabalho foram estudar o domínio PASb da HIF-3alfa humana e as prolil hidroxilases de organismos não usuais. Objetivamos ainda produzir e realizar ensaios estruturais com a isoforma PASb-3alfa4 da HIF-3alfa, porém após diversas tentativas de expressão e purificação, a proteína continuou na forma insolúvel o que impossibilitou a continuidade dos estudos. Desta forma, apresentamos a estrutura cristalográfica do domínio PASb de HIF-3alfa na resolução de 1,15 Å, na qual identificamos uma cavidade hidrofóbica volumosa exclusiva com 510Å3 ligada ao ácido graxo insaturado cis-vaccenico de 18 carbonos como um inesperado e novo cofator intracelular para HIF-3alfa. Ensaios in vitro mostraram que a proteína é capaz de se ligar a diferentes tipos de lipídeos, os quais foram submetidos à análise por espectrometria de massas através da extração da fase orgânica da amostra. Foram identificados dois fosfolípideos como sendo uma liso-fosfoetanolamina 1-(11Z-octadecenol)-2-hidroxil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (18: 1-LPE) e Liso-fosfoglicerol 1-(11Z-octadecenoil) -2-hidroxil-sn-glicerol-3-fosfo- (1'-sn-glicerol) (18:1-LPG). De modo a explorar a cavidade hidrofóbica e identificar outros lipídeos que possam se ligar a proteína, realizamos ensaio de delipidação e titulação de ácidos graxos livres com diferentes comprimentos da cadeia carbônica e níveis de insaturação, que pudessem estar presentes no organismo humano. Como resultado observamos uma alta afinidade com ácidos graxos oleico (18:1) e linoleico (18: 2) com kd de 39±1nM e 0,8±0,2 nM respectivamente. Estes resultados evidenciam que esta é a primeira vez que um domínio PAS eucariótico pode servir como um sensor para os níveis intracelulares de lipídeos, possivelmente ditando a expressão do gene dependente de HIF-3alfa em resposta a resultados biossintéticos e bioenergéticos, tais como acumulação ou depleção de lipídeos, em exposição à hipóxia. Apresentamos também os resultados da colaboração com o Dr. Christopher Schofield e seu grupo de trabalho (Chemistry Department-Oxford University), através de estudos estruturais das prolil hidroxilases (PHD1, 2 e 3) para os quais foram utilizados os genes presentes em organismos não convencionais, como morsa, ornitorrinco e python que apresentaram similaridade relativa em relação às hidroxilases humanas. Foram selecionados oito organismos, dos quais obtivemos proteínas solúveis para seis deles. Duas isoformas para a PHD3 (genes de ornitorrinco e python) se mostraram mais estáveis e foram purificadas com alto grau de pureza. Ambas as proteínas foram submetidas a teste de atividade enzimática utilizando peptídeos sintéticos da HIF-1?, onde observamos que as enzimas são ativas e hidroxilam preferencialmente à prolina contida no domínio CODD da HIF. Também foram realizados ensaios de biologia estrutural através da cristalização da PHD3 de python, o qual inicialmente apresentou a formação de esferulitas e após algumas otimizações, não obtivemos cristais únicos. Para as demais PHDs que foram obtidas na forma solúvel diversas otimizações nos protocolos de purificação tiveram de ser realizadas a fim de obter amostras mais estáveis e promissoras para os ensaios de cristalização e atividade enzimática (AU)

• Processo FAPESP: 14/04927-4 - Identificação de um inédito cofator celular dos fatores de transcrição induzíveis por hipóxia (HIF) e estudos estruturais dos domínios catalíticos das isoformas 1 e 3 das prolil-hidroxilases (PHDs) humanas em complexo com inibidores
• Beneficiário: Angela Maria Fala
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado