Análise filogenética de LRR-RLKs em Citrus e o envolvimento do receptor de EF-Tu no reconhecimento de Xylella fastidiosa: Phylogenetic analysis of Citrus LRR-RLKs and the involvement of EF-Tu receptor in Xylella fastidiosa recognition

Autor(es)

Diogo Maciel Magalhães

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-12-08

Membros da banca

Alessandra Alves de Souza; Claudia Barros Monteiro Vitorello; Michel Georges Albert Vincentz; Renato Vicentini; Ronaldo José Durigan Dalio

• Orientador: Alessandra Alves de Souza; Marco Aurélio Takita

Resumo

Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) apresentam grande importância na defesa das plantas contra microrganismos pela capacidade de reconhecerem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) em início de infecção e desencadearem respostas de imunidade inata (PTI). A ativação de PTI permite conferir resistência contra uma ampla gama de microrganismos e, assim, a identificação e compreensão do papel das PRRs é de grande relevância em estudos que visam resistência contra patógenos. As espécies de Citrus apresentam elevado interesse comercial, porém seu cultivo tem sido severamente prejudicado devido às inúmeras doenças causadas por fitopatógenos, como por exemplo, a clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidiosa. Assim, considerando que a maioria das PRRs identificadas em plantas pertence à família de quinases com repetições ricas em leucina (LRR-RLKs), um dos objetivos desse trabalho foi analisar os aspectos evolutivos das LRR-RLKs no genoma de espécies de Citrus de grande importância econômica, Citrus clementina e Citrus sinensis. O alinhamento múltiplo de sequências conservadas de quinase e a reconstrução de árvores filogenéticas estimadas por máxima verossimilhança permitiu identificar 300 e 297 LRR-RLKs nos proteomas preditos de C. clementina e C. sinensis, respectivamente. As LRR-RLKs de ambas as espécies foram classificadas em 16 subgrupos (I a XVI) e a partir de uma análise mais detalhada do subgrupo XII, que inclui os principais PRRs identificados em plantas, foi verificada uma grande expansão e clusterização nos genomas de Citrus, o que demonstra a importância de eventos de duplicação em tandem na evolução das LRR-XII em Citrus. Além das análises in sillico, neste trabalho também foi avaliado o papel do receptor de EF-Tu (EFR) no reconhecimento de X. fastidiosa. Mutantes de Arabidopsis thaliana com EFR silenciado (efr-1) foram inoculados com X. fastidiosa e, a partir de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), foi verificado um aumento significativo da população bacteriana em efr-1 durante todo o experimento, quando comparado com as plantas selvagens (WT). Em 15 dias após inoculação (DAI), foi observada uma população bacteriana quase dez vezes maior nos tecidos das plantas efr-1. Análises por microscopia de fluorescência confirmaram a elevada colonização bacteriana nos tecidos das plantas efr-1. A importância do EFR no reconhecimento de X. fastidiosa foi avaliada também pela superexpressão de AtEFR em plantas hospedeiras de tabaco, as quais apresentam susceptibilidade a X. fastidiosa. Vinte plantas transgênicas foram identificadas por PCR convencional e a expressão do transgene EFR foi confirmada em seis eventos por qRT-PCR. Análises por western blot confirmaram a presença da proteína heteróloga e a maior produção de ROS verificada em presença dos epítopos elf18 de X. fastidiosa, E. coli e Xanthomonas citri subsp. citri indicam ativação de PTI nas plantas transgênicas de tabaco. A redução significativa na incidência de sintomas nas plantas transgênicas inoculadas com X. fastidiosa demonstra que EFR conferiu ao tabaco maior resistência à infecção bacteriana. Os resultados obtidos em Arabidopsis e tabaco indicam que EFR pode ser uma boa estratégia para transformar espécies susceptíveis de Citrus visando resistência contra X. fastidiosa e X. citri (AU)

• Processo FAPESP: 13/01412-0 - Análise filogenética de RLK-LRRs em citros e envolvimento do receptor de EF-Tu no reconhecimento de Xylella fastidiosa
• Beneficiário: Diogo Maciel de Magalhães
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado