A descoberta da interação entre miosina Va e RPGRIP1L: caracterização do complexo e localização no centrossomo = The discovery of the interaction between myosin Va and RPGRIP1L: characterization of the complex and localization at the centrosome

Autor(es)

Leandro Henrique de Paula Assis

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-08-18

Membros da banca

Mário Tyago Murakami; Carmen Veríssima Ferreira; Daniel Martins de Souza; Rafael Victório Carvalho Guido; Marcos Vicente de Albuquerque Salles Navarro

• Orientador: Jörg Kobarg; Mário Tyago Murakami

Resumo

A miosina Va (MioVa) humana é uma proteína motora dimérica que utiliza a energia liberada pela hidrólise do ATP para se mover ao longo dos filamentos de actina. Sua principal função está relacionada ao transporte de cargas na célula, as quais compreendem vesículas, organelas, RNA mensageiro e proteínas regulatórias. Para que este ocorra, as cargas são ancoradas ao domínio de ligação a cargas (CBD) localizado na extremidade C-terminal da miosina. Normalmente, a ligação não ocorre de modo direto, mas é mediada por proteínas parceiras, algumas vezes também chamadas adaptadoras, as quais estão localizadas na superfície da carga. Por esse motivo, mutações nos genes que codificam a MioVa ou uma de suas proteínas parceiras estão associadas à patologias, incluindo a síndrome de Griscelli tipo 1, caracterizada por albinismo e problemas neurológicos. Embora a MioVa seja alvo de intenso estudo, ainda são poucas as proteínas parceiras descritas, dificultando a compreensão de vários processos celulares que dependem desse motor molecular. Para suprir essa carência, nós buscamos novos parceiros de interação para a MioVa através de screening em biblioteca de cDNA de cérebro fetal humano através de duplo-híbrido. Após a etapa de validação, nós selecionamos a proteína RPGRIP1L como alvo dos nossos estudos. A RPGRIP1L é uma proteína multidomínio que faz parte do sistema cílio-centrossomo, sendo importante para a formação da zona de transição na base do cílio primário, organela envolvida na captação de uma ampla variedade de sinais extracelulares. Usando ensaios de GST-pull down e termoforese em microescala nós mostramos que a MioVa-CBD se liga aos domínios C2 da RPGRIP1L com baixa afinidade (KD entre 3 e 9 µM), o que é típico de interações transientes entre proteínas. Além do mais, nossos resultados de duplo-híbrido usando mutações pontuais na superfície da MioVa-CBD indicaram que os resíduos W1713, Y1721, Q1755 e F1792 fazem parte do sítio de reconhecimento da RPGRIP1L. Estes resíduos são totalmente conservados na MioVb, e nossos resultados mostraram que esta miosina também interage com a RPGRIP1L. Ensaios de proximidade de ligação e microscopia confocal indicaram a interação física entre MioVa e RPGRIP1L nos centrossomos durante a mitose e na base do cílio primário durante a intérfase. Surpreendentemente, nós também observamos MioVa ao longo do cílio primário, um fato novo e inesperado, uma vez que esta organela é formada basicamente por microtúbulos. Juntos, nossos resultados revelam a RPGRIP1L como uma nova parceira de interação da MioVa, abrindo perspectivas para a compreensão do papel deste motor molecular no centrossomo e no cílio primário (AU)

• Processo FAPESP: 11/20229-7 - Miosina-5A humana e o transporte intracelular de cargoes: estudos dos complexos de miosina-5A e proteínas adaptadoras
• Beneficiário: Leandro Henrique de Paula Assis
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto