Caracterização funcional de uma quitinase do fungo Moniliophthora perniciosa com possível papel na patogenicidade sobre o cacaueiro durante a doença vassoura de bruxa

Autor(es)

Gabriel Lorencini Fiorin

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2016-08-25

Membros da banca

Gonçalo Amarante Guimarães Pereira; Fabio Papes; Antonio Vargas de Oliveira Figueira

• Orientador: Paulo José Pereira Lima Teixeira; Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

Resumo

O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma cultura perene de notável importância econômica mundial, sendo historicamente responsável pela geração de riquezas para o país. A produtividade da cacauicultura brasileira foi drasticamente reduzida ao longo dos anos 90, quando a doença vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, se espalhou pela principal região produtora do Brasil, o sul da Bahia. O impacto desta grave fitopatologia vem trazendo problemas de ordem econômica, social e ambiental para o país, o que torna imperativo o desenvolvimento de estratégias eficientes para o seu controle. Importantes avanços na compreensão das estratégias de patogenicidade do fungo vêm sendo alcançados com o estudo do seu genoma e investigação de dados transcriptômicos da interação M. perniciosa ¿ cacaueiro. Notavelmente, a inspeção dos dados de expressão gênica revelou que uma quitinase de M. perniciosa (Mp-chi) figura entre os genes alta e exclusivamente expressos durante a fase biotrófica da infecção do cacaueiro. Surpreendentemente, no entanto, esta proteína apresenta duas substituições de aminoácidos que presumivelmente levam à ausência de atividade quitinolítica. Tais propriedades sugeriam que a quitinase Mp-Chi não participasse do catabolismo de quitina e que, em vez disso, poderia estar envolvida em alguma função de patogenicidade. Uma vez que a proteína possui os resíduos de interação com o seu substrato (quitina) conservados, o seu papel na interação poderia estar relacionado com a ligação à quitina. A fim de esclarecer o papel funcional da Mp-Chi durante a vassoura de bruxa, a quitinase de M. perniciosa foi expressa em sistema heterólogo e submetida a testes funcionais in vitro. Os resultados obtidos indicaram que, de fato, a Mp-Chi é cataliticamente inativa. A capacidade quitinolítica da proteína é restabelecida a partir da restauração de ambos os resíduos conservados do seu domínio catalítico, o que demonstra que a ausência de atividade se deve pelo menos a essas duas substituições. Testes de afinidade a carboidratos confirmaram que a Mp-Chi é capaz de se ligar à quitina e quito-oligômeros, o que a capacitaria para agir como um fator de patogenicidade de M. perniciosa, atuando na proteção da parede celular do fungo contra enzimas hidrolíticas da planta ou na supressão da imunidade vegetal desencadeada por quitina. Utilizando plataformas experimentais modelo, os potenciais papeis da proteína no contexto da doença foram avaliados. A quitinase de M. perniciosa não exibiu capacidade protetora, mas preveniu a ativação da imunidade vegetal elicitada por quitina. Notavelmente, esta função foi abolida em uma versão mutante da proteína com afinidade reduzida à quitina, demonstrando que, de fato, a capacidade de ligação à quitina é a propriedade funcional chave para que a Mp-Chi exerça sua função de patogenicidade. Conjuntamente, os resultados obtidos confirmam que a Mp- Chi se constitui em um potencial efetor de M. perniciosa envolvido na prevenção do reconhecimento do fungo pela planta, contribuindo para o sucesso da colonização do cacaueiro por M. perniciosa. A caracterização funcional desta quitinase na doença vassoura de bruxa representa um importante passo na compreensão das estratégias de evasão de M. perniciosa contra as defesas da planta, assim como compreende uma novidade relevante para a fitopatologia. Adicionalmente à caracterização funcional da Mp-Chi, no sentido de viabilizar a realização de estudos funcionais in vivo, foi iniciado o desenvolvimento de uma metodologia para manipulação genética de M. perniciosa utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9. O vetor contendo todos os elementos necessários para a edição do genoma do fungo foi construído e permitirá a transformação do fungo. Uma vez estabelecido, o procedimento poderá ser utilizado para produção de linhagens deficientes no gene Mp-chi e inúmeros outros genes de interesse, constituindo-se em uma poderosa ferramenta para o estudo dos fatores envolvidos na patogenicidade de M. perniciosa (AU)

• Processo FAPESP: 14/06181-0 - Estabelecimento de uma metodologia baseada no sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genética do fungo Moniliophthora perniciosa, causador da vassoura de bruxa do cacaueiro
• Beneficiário: Gabriel Lorencini Fiorin
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado