Geração e caracterização de tecido equivalente endotelial e seu potencial osteopromotor

Autor(es)

Georgia da Silva Feltran

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Botucatu. 2019-05-14.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências. Botucatu
• Data de defesa: 2019-04-26
• Orientador: Willian Fernando Zambuzzi

Resumo

Com o aumento progressivo da expectativa de vida da população, defeitos ósseos se tornou um problema de saúde pública. Por sua vez, o sistema esquelético abriga um conjunto de células que, de maneira hierárquica, sustentam a formação do osso ao longo da vida, sendo sua capacidade regenerativa comprometida durante o processo de envelhecimento. Com o aumento da expectativa de vida, a população idosa vem crescendo nos últimos anos e com ela o aumento eminente de fraturas ósseas. Sabe-se que o desenvolvimento e regeneração ósseos são eventos complexos e controlados por mecanismos parácrinos de sinalização intercelulares, destacando que a osteogênese está acoplada, principalmente, à angiogênese. Embora relatado, este mecanismo de comunicação entre células endoteliais e células osteoprogenitoras não está bem elucidado, sobretudo considerando o repertório de moléculas tróficas envolvidas. A fim de compreender melhor estes mecanismos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologias capazes de mimetizar o microambiente endotelial-ósseo, bem como desvendar eventos acoplados entre os diferentes tipos celulares envolvidos no processo, sobretudo gerando tecido endotelial in vitro, equivalente ao original. Para isso, fizemos uso de células humanas primárias, as quais foram submetidas a diferentes protocolos experimentais, onde a mesma densidade de células endoteliais arterial (HCAEC) e venosa (HUVEC) e de musculatura lisa (AoSMC) (cultivo misto) foi plaqueada em tubos cônicos sem tratamento e, após 72 horas, os esferóides gerados foram tecnicamente processados para caracterização bioquímica (expressão das proteínas CD31 e α-SMA pelas células endoteliais e musculares lisa, respectivamente), estrutural (através de microscopia eletrônica) e morfológica (avaliações histológicas). Os resultados obtidos demonstram uma sequência experimental capaz de gerar esferóides de tecido endotelial com propriedades funcionais. Como nota, essas análises preliminares mostram uma concentração de células endoteliais (positivas para CD31+) ao centro do esferóide, enquanto células de musculatura lisa concentram-se perifericamente (positivas para α-SMA), estabelecendo uma distribuição hierárquica-estrutural entre as duas linhagens primárias. Os dados moleculares aqui obtidos evidenciam que estes eventos de homeostase do tecido requerem processamento de microRNAs (miRs) e envolvimento do fator indutor de hipóxia (HIF-1α), o qual foi significantemente mais expresso por células de musculatura lisa, localizada na periferia do tecido gerado. Os resultados mostram ainda que os esferóides gerados expressam biomarcadores osteogênicos (RUNX 2, OTX, ALP), podendo, assim, contribuir com eventos de diferenciação osteoblástica. Variando estratégias experimentais através da modulação da atividade de HIF-1α, mostramos haver efeito diferencial entre esferóides arteriais e venosos, em processos de diferenciação osteoblástica a partir de células indiferenciadas (CTM-MS). Em conjunto, os dados demonstram que a metodologia investigada fornece um fluxo experimental capaz de gerar um modelo de cultura 3D de tecido equivalente endotelial venoso e arterial, com propriedades celulares, bioquímicas e ultra-estruturais definidas, capazes de contribuírem paracrinamente com a fenótipo osteogênico com envolvimento dinâmico e diferencial de HIF-1α. (AU)

• Processo FAPESP: 16/20505-8 - Geração e caracterização de esferoides de tecido endotelial e seu potencial osteopromotor
• Beneficiário: Geórgia da Silva Feltran
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado