Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em plantas

Autor(es)

Juliana Crotti Franco

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Química
• Data de defesa: 2018-03-22

Membros da banca

Carlos Henrique Inacio Ramos; Fábio Cesar Gozzo; Jörg Kobarg

• Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos

Resumo

A chaperona Hsp100, que está presente desde bactérias até plantas, mas não em metazoários, tem a importante função de desagregase, auxiliando proteínas a serem recuperadas e reenoveladas. Estudos recentes sugeriram que, em células animais, a co-chaperona Hsp110 coopera com a Hsp70 em um eficiente sistema de desagregação. Como plantas expressam tanto a Hsp100 quanto a Hsp110, nos perguntamos se a Hsp110 poderia ser parte de um sistema de desagregação adicional neste organismo (no caso sorgo), uma vez que plantas enfrentam condições estressantes mais severas do que os animais. Tendo identificado o gene para esta proteína em sorgo utilizou-se o sistema pET de expressão em células de E. coli e purificação usando cromatografia de afinidade em níquel seguida de cromatografia de exclusão molecular. Uma combinação de técnicas espectroscópicas e hidrodinâmicas foi utilizada para a caracterização da conformação da proteína, enquanto que experimentos envolvendo proteção contra agregação e ensaios de reenovelamento e desagregação de substratos modelo foram utilizados para a caracterização funcional. O gene foi clonado e a proteína foi expressa solúvel, sendo que após purificação verificou-se que a mesma foi produzida enovelada (cerca de 40 % da sua cadeia polipeptídica encontra-se na forma de hélice ?) e estável, mantendo estrutura secundária até 48 °C e aproximadamente 2 mol L-1 de ureia. Medidas hidrodinâmicas indicaram que a proteína é um monômero alongado com massa molecular de 98 kDa (sendo o valor esperado pela sequência de 95,23 kDa). A Hsp110 mostrou também ser funcional ao apresentar atividade chaperona e ser capaz de, em conjunto com outras proteínas do sistema Hsp70, reenovelar e desagregar o substrato modelo testado. Estes resultados apoiam a hipótese de que plantas possuem mais de um sistema capaz de atuar na desagregação de proteínas aumentando seu poder de tolerar os diversos tipos de estresse a que estão expostas (AU)

• Processo FAPESP: 16/02137-1 - Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína Hsp110 de sorgo visando a compreensão do sistema de desagregação de proteínas em plantas
• Beneficiário: Juliana Crotti Franco
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado