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Análise da co-regulação transcricional e identificação de genes de interesse biotecnológico em Trichoderma reesei

Texto completo
Autor(es):
Gustavo Pagotto Borin
Número total de Autores: 1
Tipo de documento: Tese de Doutorado
Imprenta: Campinas, SP.
Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
Data de defesa:
Membros da banca:
Juliana Velasco de Castro Oliveira; Anete Pereira de Souza; Rafael Silva Rocha; Richard John Ward; Marcelo Mendes Brandão
Orientador: Juliana Velasco de Castro Oliveira
Resumo

Os biocombustíveis, em particular o etanol de segunda geração (2G), são hoje uma das principais alternativas sustentáveis à substituição dos combustíveis fósseis em direção à consolidação de uma bioeconomia circular. No Brasil, o etanol 2G é produzido a partir do bagaço e palha da cana-de-açúcar, que são resíduos lignocelulósicos gerados em abundância na cadeia produtiva do setor sucroenergético. Esta tecnologia, entretanto, apresenta ainda algumas limitações econômicas, como o custo elevado dos coquetéis enzimáticos necessários à hidrólise da biomassa lignocelulósica. O fungo filamentoso Trichoderma reesei é considerado a principal plataforma biológica da produção e secreção de celulases e hemicelulases que compõem os coquetéis enzimáticos. Embora o sistema celulolítico e regulação transcricional de T. reesei sejam muito estudados, ainda é necessário investigar o conjunto total de genes relacionados com a degradação de biomassa lignocelulósica por este fungo. Assim, os objetivos principais deste estudo foram a inferência de uma rede de co-expressão gênica baseada no transcriptoma de T. reesei RUT-C30 e a caracterização de alguns genes identificados com potencial biotecnológico em cepas mutantes knockout. A inferência da rede separou os genes hiper-expressos em bagaço (BEX) em diversos módulos, de acordo com o perfil de expressão gênica. Vários genes de (hemi)celulases, transportadores de açúcar, fatores de transcrição e proteínas hipotéticas foram co-expressos nos mesmos módulos. Genes centrais destes módulos (hubs) foram identificados, e incluíram fatores de transcrição e proteínas hipotéticas ainda não caracterizados. A predição in silico de sítios de ligação ao DNA na região promotora para XYR1, o principal ativador de celulases, revelou ainda genes interessantes que podem ser regulados por este fator de transcrição. A partir da análise de rede, seis genes foram escolhidos para serem deletados e caracterizados em T. reesei. Quatro deles foram deletados com sucesso e um gene codificando para um fator de transcrição hipotético do tipo zinc finger mostrou ter papel positivo sobre a degradação de bagaço, uma vez que sua deleção diminuiu significativamente as atividades de celobiohidrolase (pNPC) e beta-glicosidase (pNPG) nesta fonte de carbono. Dados de expressão gênica por qPCR demonstraram também que este gene é alvo da repressão catabólica por carbono mediada pelo regulador CRE1. Adicionalmente, o perfil metabólico de T. reesei e Aspergillus niger crescidos em glicose, celulose solúvel (CMC), lactose e bagaço pré-tratado foi investigado por RMN para avaliar as vias metabólicas utilizadas por estes dois fungos industriais. A fonte de carbono utilizada foi a maior responsável pela variação dos dados, sugerindo que ambos os fungos adotam estratégias semelhantes para crescerem e se adaptarem aos substratos avaliados, mesmo tendo evoluído independemente. Metabólitos de reserva de energia (manitol e trealose), de metabolismo de fosfolipídeos (glicerol-3-fosfocolina) e de aminoácidos (glutamina, alanina e glutamato) foram significativamente mais abundantes em todas as condições amostradas para ambos os fungos. T. reesei assimilou de forma mais eficiente o açúcar lactose, e também parece ativar a via alternativa do TCA (glyoxalate shunt) em CMC como estratégia para produzir energia pela gliconeogênese. A. niger, por outro lado, mostrou níveis mais altos de glicerol e GABA em CMC e lactose. Em BEX, A. niger teve as maiores atividades enzimáticas para celulase e hemicelulase, contribuindo para maior ativação da via glicolítica. Como conclusões deste trabalho, a análise da rede de co-expressão gênica permitiu a identificação de um grande número de genes com potencial biotecnológico na degradação de bagaço de cana. A caracterização dos mutantes knockout levou à descoberta de um suposto ativador transcricional de celulases, mas estudos adicionais devem ser realizados para compreender melhor sua atuação sobre a regulação gênica em T. reesei. O perfil metabólico de T. reesei e A. niger revelou ainda que ambos os fungos utilizam estratégias parecidas com poucas diferenças na utilização de diferentes fontes de carbono, e contribuiu para a maior compreensão da fisiologia dos fungos em condições que induzem a produção de enzimas hidrolíticas. Por fim, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para o maior entendimento do sistema celulolítico em T. reesei e podem ajudar a reduzir os custos associados ao etanol 2G (AU)

Processo FAPESP: 15/08222-8 - Análise da co-regulação transcricional e identificação de genes de interesse biotecnológico em Trichoderma reesei
Beneficiário:Gustavo Pagotto Borin
Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado