Identificação de micrornas diferencialmente expressos em células pulmonares e pancreáticas transformadas pelo oncogene KRAS

Autor(es)

Mateus Nóbrega Aoki

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ)
• Data de defesa: 2014-07-04

Membros da banca

Daniela Sanchez Bassères; Roger Chammas; Silvya Stuchi Maria Engler; Eduardo Moraes Rego Reis; Deborah Schechtman

• Orientador: Daniela Sanchez Bassères

Resumo

As neoplasias induzidas pela forma oncogênica da KRAS são doenças muito comuns, para as quais não existem terapias efetivas. Uma inibição direta da KRAS falhou em ensaios clínicos e esforços intensos tem sido feitos para identificar alvos de KRAS importantes para a oncogênese. Uma via promissora regulada por KRAS, que tem sido pouco explora a é a via dos microRNAs (miRNAs). Nossa meta foi identificar miRNAs regulados pela KRAS em células pulmonares e pancreáticas, que possam contribuir para o fenótipo oncogênico. Para alcançar esta meta nós usamos duas abordagens: (1) Nós investigamos o miRNA 486-5p como um alvo de KRAS em câncer de pâncreas e de pulmão. A expressão deste miRNA havia sido correlacionada positivamente com a presença de mutações em KRAS em pacientes portadores de câncer de cólon; (2) Nós usamos uma plataforma de microarranjo para identificar miRNAs diferencialmente expressos entre células humanas primárias imortalizadas pulmonares ou pancreáticas e suas linhagens isogênicas transformadas por KRAS. Na primeira abordagem, conseguimos mostrar que a expressão do miRNA 486-5p está correlacionada ao status de KRAS em células primárias pulmonares, mas não em células primárias pancreáticas. Além disso, geramos células pulmonares tanto com ganho e perda de função de KRAS e demonstramos que KRAS regula a expressão do miRNA 486-5p. Também de terminamos uma correlação negativa entre a expressão de KRAS e a expressão do alvo do miRNA 486-5p FoxO1, um supressor tumoral. Para avaliar como o miRNA 486-5p afeta as propriedades oncogênicas induzidas por KRAS, nós transfectamos oligonucleotídeos inibitórios para o miRNA 486-5p em células pulmonares positivas para mutações em KRAS. A inibição da expressão do miRNA 486-5p levou a uma redução da clonogenicidade e viabilidade celulares. Esta redução não está associada a um aumento de morte celular, mas a uma redução da proliferação celular. Interessantemente, a transfecção de oligonucleotídeos mímicos do miRNA 486-5p em células pulmonares negativas para mutações em KRAS ou em células com perda de função de KRAS por RNAi levou a um aumento da proliferação e clonogenicidade. Estes dados indicam que o miRNA 486-5p, não só é um alvo de KRAS em câncer de pulmão, mas também age como um oncomiR contribuindo para a proliferação celular induzida por KRAS. Na nossa segunda abordagem, nós identificamos 17 miRNAs com expressão aumentada e 3 com expressão diminuída em células primárias pancreáticas expressando KRAS oncogênica. Destes, 9 miRNAs foram foram também identificados por metanálise de dados de microarranjo publicados comparando amostras tumorais pancreáticas com amostras não tumorais. Apesar do experimento de microarranjo com as linhagens primárias pulmonares não ter produzido resultados estatisticamente significativos após a correção por FDR, uma tendência à expressão diferencial foi observada para vários miRNAs e nós validamos por qPCR a expressão diferencial dos miRNAs 720 e 139-3p. Em conclusão, nós conseguimos identificar miRNAs regulados pela KRAS tanto em células pulmonares, quanto pancreáticas. Um melhor entendimento das suas funções biológicas, bem como dos alvos por eles regulados nestes contextos, pode revelar novas vias para a exploração terapêutica. (AU)

• Processo FAPESP: 11/06709-6 - Identificação de micro RNAs diferencialmente expressos em células pulmonares e pancreáticas transformadas pelo oncogene K-Ras
• Beneficiário: Mateus Nóbrega Aoki
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado