Sistema automatizado para estimulação elétrica e avaliação da dinâmica do cálcio intracelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Autor(es)

Douglas Martins Veronez

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: São Paulo.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Escola Politécnica (EP/BC)
• Data de defesa: 2018-05-15

Membros da banca

Idágene Aparecida Cestari; Maria Claudia Costa Irigoyen; Cinthia Itiki; Jose Carlos Teixeira de Barros Moraes; Mario Ricardo Gongora Rubio

• Orientador: Idágene Aparecida Cestari

Resumo

Este estudo apresenta o desenvolvimento e validação de uma nova abordagem para a avaliação do cálcio intracelular em culturas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC-CM - do inglês human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes) que pode ser aplicada para avaliar o efeito de drogas no acoplamento excitação-contração. O método consiste na estimulação elétrica e medição conjunta da fluorescência de forma automatizada e foi viabilizado a partir da inclusão de um sistema de estimulação elétrica em um leitor de ELISA (do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Um estimulador eletrônico compacto foi projetado para operar junto a um leitor de placas gerando pulsos quadrados monofásicos com duração de 5 ms e campo elétrico de 8 Vcm-1 aplicados por microeletrodos metálicos de platina-irídio em células em cultura. Uma placa de cultura normalmente utilizada em leitor de placas foi modificada para permitir a colocação do estimulador e dos eletrodos. A intensidade de fluorescência do cálcio intracelular foi avaliada utilizando um leitor de ELISA durante a estimulação elétrica em culturas de células marcadas com o indicador de Ca2+ Fluo-4 AM. A estimulação elétrica das células resultou em contrações regulares nas frequências de 0,1 Hz; 0,2 Hz; 0,3 Hz e 0,5 Hz induzidas pelo estimulador. Parâmetros dos transientes de cálcio foram estudados após a exposição de culturas de células ao Verapamil (0,05; 0,5 e 5,0 µM), a amplitude e a inclinação máxima da fase de subida foram progressivamente reduzidas com doses crescentes da droga. Os dados obtidos demonstraram que o método apresentado permite a avaliação automatizada de transientes de cálcio durante a estimulação elétrica de culturas de hiPSC-CM utilizando o sistema de estimulação em um leitor de ELISA. Esses resultados validaram a aplicabilidade do sistema ao estudo das alterações da dinâmica do cálcio intracelular induzidas por drogas em células sob estimulação elétrica. O sistema de avaliação automatizada desenvolvido pode ser ampliado para realizar a triagem de alto rendimento em bibliotecas de compostos que tem como alvo o acoplamento excitação-contração em células cardíacas humanas in vitro. (AU)

• Processo FAPESP: 13/24544-0 - Propriedades elétricas do músculo cardíaco após implante de dispositivo de assistência ventricular pediátrico
• Beneficiário: Douglas Martins Veronez
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto