Caracterização da interação da proteína TIPRL com fosfatases tipo 2A em cultura de células

Autor(es)

Ana Amélia Sanchez Iacia

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2021-05-25

Membros da banca

Juliana Helena Costa Smetana; Daniel Maragno Trindade; Luis Antonio Peroni; Matheus de Castro Fonseca; Fábio Cesar Gozzo

• Orientador: Juliana Helena Costa Smetana

Resumo

TIPRL (TOR Signaling Pathway Regulator-like) é uma proteína reguladora que interage com as subunidades catalíticas das fosfatases do tipo 2A (PP2A, PP4 e PP6), um conjunto de fosfatases de fosfosserina e fosfotreonina que responde por grande parte dos eventos de desfosforilação intracelulares. Essas fosfatases regulam vários processos celulares, como apoptose, resposta a danos no DNA e divisão celular, e PP2A é um importante supressor tumoral, regulando negativamente diversas vias de sinalização oncogênicas. TIPRL é superexpressa em diversos carcinomas humanos e possivelmente exerce uma função pró-tumoral através da inibição de PP2A por mecanismos ainda pouco compreendidos. TIPRL apresenta um enovelamento único com uma fenda conservada na qual se liga a cauda carboxiterminal conservada da subunidade catalítica da PP2A (PP2Ac), e presumivelmente também de PP4c e PP6c que apresentam similaridade de sequência com PP2Ac nessa região. Essa cauda abriga dois sítios de fosforilação (T304 e T307) e um de carboximetilação (L309), onde sofre modificações pós-traducionais reversíveis que regulam o recrutamento seletivo de subunidades regulatórias. A fosforilação inibe a PP2Ac e prejudica a formação da holoenzima ativa, que é composta por uma subunidade de ancoragem (PR65/A) e um subconjunto de subunidades regulatórias (B, B’, B" e striatinas). Já a metilação é necessária para o recrutamento de algumas subunidades tipo B. TIPRL inibe a atividade de PP2A in vitro, porém o mecanismo de regulação de PP2A por TIPRL na célula ainda não foi elucidado. Mais especificamente, a consequência funcional dessas modificações na interação com TIPRL ainda é desconhecida. Neste trabalho, examinamos a interação entre PP2Ac e TIPRL usando linhagens celulares que expressam de forma estável (NIH/3T3 e N2a), ou transiente (HEK293T), mutantes fosfomiméticos e suas respectivas contrapartes não fosforiláveis, assim como mutantes da leucina no C-terminal da PP2Ac que impedem a carboximetilação. Em análises de imunoprecipitação e Western blot, observamos que a interação de TIPRL é extremamente sensível às mutações no C-terminal da PP2Ac, e também ao pH. A mutação fosfomimética T304D aumentou significativamente a interação de TIPRL com PP2Ac, já as mutações Y307F, Y307E e L309? aboliram completamente a interação. TIPRL interagiu exclusivamente com a versão não metilada da PP2Ac. A superexpressão de TIPRL diminuiu a interação de PP2Ac com a subunidade B em células transfectadas transientemente, mas esse resultado não se reproduziu em linhagens estáveis. Foram analisadas ainda as interações de mutantes da TIPRL com as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c. Esses mutantes foram selecionados por seu potencial de abolir a interação com a cauda da PP2Ac, porém, alguns deles surpreendentemente tiveram ganho de interação com PP4c e PP6c. As linhagens estáveis desenvolvidas neste trabalho permitiram analisar a interação de TIPRL e PP2Ac de forma semi-quantitativa e reprodutível. A preferência de TIPRL pela versão não metilada de PP2Ac e pelo mutante fosfomimético é T304D condizente com um papel de TIPRL nas etapas iniciais da biogênese da PP2A (AU)

• Processo FAPESP: 16/12560-9 - Caracterização da função da proteína regulatória TIPRL na biogenese das fosfatases 2A em células normais e cancerígenas
• Beneficiário: Ana Amélia Sanchez Iacia
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado