Caracterização funcional e da dinâmica espacial da miosina-Va no processo de fissão mitocondrial

Autor(es)

Jackeline Souza Araújo

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2021-03-29

Membros da banca

Enilza Maria Espreafico; Alícia Juliana Kowaltowski; Mário Tyago Murakami; Luis Lamberti Pinto da Silva

• Orientador: Enilza Maria Espreafico

Resumo

A arquitetura mitocondrial está envolvida em várias funções cruciais para a viabilidade celular, como proliferação, senescência e sinalização. Em particular, a dinâmica mitocondrial através do equilíbrio entre fusão e fissão mitocondriais desempenha um mecanismo central para ajustar as necessidades metabólicas da célula. Recentemente, tem se dado um grande foco à participação do citoesqueleto e dos motores moleculares nos processos requeridos para homeostase mitocondrial. Em especial, a proteína mitoSpire1, uma proteína nucleadora de actina que possui localização mitocondrial, foi mostrada ser importante na fissão mitocondrial. Interessantemente, proteínas Spire interagem com os motores moleculares miosina-V. A miosina-Va, um motor molecular dependente da actina, está envolvida em diversas funções cruciais para célula e dados já publicados do nosso laboratório indicam que ela também tem uma localização mitocondrial. Devido a isso, nós postulamos que a miosina-Va estaria envolvida nos processos de dinâmica mitocondrial. Para responder a estas questões, inicialmente nós confirmamos a localização da miosina-Va na superfície mitocondrial através de imagens confocais e de super-resolução. Posteriormente, vimos que a miosina-Va interage diretamente com mitoSpire1, e que seu recrutamento para MME aumenta com a superexpressão de mitoSpire1, tornando a sua interação mitocondrial ainda mais evidente. Para entendermos se a miosina-Va desempenha algum papel referente à mitocôndria, nós a modulamos em células de melanoma A375 através do silenciamento com shRNAs e do nocaute (KO) utilizando CRISPR. Observamos que estas células possuem mitocôndrias alongadas e com um menor número de eventos de fissão após a depleção da miosina-Va. Esse fenótipo é resgatado através da superexpressão de um construto contendo a miosina-Va inteira. Além disso, através de vídeo-microscopias nós observamos que a miosina-Va é localizada nos pontos de fissão mitocondrial, e que essa localização é parcialmente perdida em células KO para mitoSpire1. Em busca do mecanismo pelo qual a miosina-Va interfere na fissão mitocondrial, nós investigamos a sua interação com outras proteínas importantes deste processo. A partir disso, observamos que a localização da miosina-Va nos pontos de fissão mitocondrial coincide também com agrupamentos de Drp1, que é a principal proteína responsável pela fissão mitocondrial. Nossos dados também mostram a interessante localização conjunta da miosina-Va com Rab11a nos pontos de fissão mitocondrial, a qual também é parcialmente perdida em células KO para mitoSpire1. Por fim, nós vimos que as células KO para miosina-Va possuem menores taxas de consumo de oxigênio, quando comparadas com células controle, assim como menores níveis de produção de ATP. Em busca das consequências dessa menor eficiência energética, nós avaliamos algumas funções tumorigênicas das células, como a clonogenicidade e a migração, vimos que estas capacidades se encontram diminuídas após o KO da miosina-Va. Portanto, nossos dados são indicativos de um papel da miosina-Va na fissão mitocondrial, e nos indicam que possivelmente a miosina-Va, mitoSpire1 e Rab11a funcionem como um complexo proteico envolvido na regulação da fissão mitocondrial. Concluindo, a falta de função da miosina-Va provoca um desequilibro na fissão mitocondrial associada a uma menor eficiência energética, que leva a uma diminuição das propriedades tumorigênicas das células de melanoma A375 e podem explicar algumas das disfunções neuromusculares severas associadas com a Síndrome de Griscelli tipo 1. (AU)

• Processo FAPESP: 16/10862-8 - Estudo do papel da miosina-Va nos processos da dinâmica mitocondrial e mitofagia
• Beneficiário: Jackeline Souza Araújo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto