Análise estrutural de halogenases encontradas em clusters gênicos da biossíntese de antibióticos glicopeptídicos

Autor(es)

Tábata Peres Cardoso

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São José do Rio Preto. 2016-05-17.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas. São José do Rio Preto
• Data de defesa: 2015-08-10
• Orientador: Marcio Vinícius Bertacine Dias

Resumo

Vários experimentos têm comprovado que compostos naturais podem ter sua atividade biológica alterada devido à presença ou ausência de halogênios ligados. Os antibióticos glicopeptídicos, como a vancomicina e teicoplanina são produtos naturais halogenados que apresentam destacada importância. Halogenases são enzimas que catalizam a transferência de halogênios para um determinado substrato, porém são muito pouco estudadas, principalmente aquelas envolvidas na biossíntese de produtos naturais, como antibióticos glicopeptídicos, mesmo com o seu potencial de aplicação em biologia sintética. Cepas produtoras de glicopeptideos foram obtidas da coleção NRRL e crescidas em meio TSB. O DNA foi extraído e os genes de 3 diferentes halogenases (staI e staK de Streptomyces toyocaensis, composto 47934 and Orf8* de Actinoplanes teichomyceticus, Teicoplanina) foram clonados em pET28a e pET20a. Um gene sintético foi obtido para enzima ComH (biossíntese de complestatina) e clonado em pET28a. A expressão desses genes foi induzida por IPTG e a purificação se deu em colunas de afinidade e gel filtração. Foram realizados estudos biofísicos (CD e DLS da StaI), bem como modelagem molecular e ensaios de complementação para proteínas StaK e StaI. Três halogenases foram purificadas, StaI, StaK e ComH e apresentaram coloração amarela indicando a co-purificação com FAD. Orf8* apresentou-se somente na fração insolúvel. Análises de CD indicam a presença de -hélices e folhas-β e foi possível observar o estado de oligomerização e polidispersividade em diferentes condições para halogenase StaI. Os modelos moleculares deram insights sobre uma possível diferença de padrão de halogenação catalizada pela StaI e StaK, devido à diferença de resíduos hidrofóbicos que formam os sulcos do sítio ativo. Tentativas de ensaios de cristalização para as enzimas StaI, StaK e ComH foram realizadas. No entanto, apenas a... (AU)

• Processo FAPESP: 12/23427-7 - Análise estrutural de halogenases identificadas em clusters gênicos da biossíntese de antibióticos glicopeptídicos
• Beneficiário: Tábata Peres Cardoso
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado