Texto completo
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| Autor(es): |
Henrique Iglesias Neves
Número total de Autores: 1
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| Tipo de documento: | Tese de Doutorado |
| Imprenta: | São Paulo. |
| Instituição: | Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas (ICB/SDI) |
| Data de defesa: | 2020-04-16 |
| Membros da banca: |
Beny Spira;
Regina Lúcia Baldini;
Rodrigo da Silva Galhardo;
Teca Calcagno Galvao
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| Orientador: | Beny Spira |
| Resumo | |
O regulon PHO de Escherichia coli compreende o conjunto de genes cuja transcrição é diretamente regulada pela concentração do íon ortofosfato (Pi) no periplasma. Sua transcrição é controlada pelo sistema de dois componentes PhoB-PhoR e pelo transportador de Pi PstSCAB-PhoU. Mutantes PHO-constitutivos, que expressam os genes de PHO independente da concentração de Pi, podem ser selecionados em meios cuja única fonte de carbono é glicerol-2-fosfato (G2P). O crescimento dos mutantes é viabilizado pela hidrólise de G2P no periplasma, resultando em glicerol e Pi. a enzima responsável por essa reação - a fosfatase alcalina - é parte do regulon PHO e está expressa constitutivamente nos mutantes. O aparecimento de mutantes PHO-constitutivos segue um padrão semelhante ao encontrado para mutações adaptativas, que surgem após o contato com a pressão seletiva e novos mutantes se acumulam nas placas ao longo dos dias. Diferentemente de outros sistemas mutacionais, não são observados mutantes PHO-constitutivos pré-existentes e todos os mutantes surgem a partir do terceiro dia de incubação. Não há, porém, impedimento teórico para a ocorrência de mutações na pré-cultura. Na primeira parte deste trabalho, foi caracterizado o fenômeno relativo à ausência de mutações PHO-constitutivas precoces. É demonstrado que este fenômeno se deve à inibição de crescimento dos mutantes exercida pelas bactérias selvagens. Esta inibição depende da proximidade física entre as duas populações, sem necessidade de contato direto. A varredura de uma biblioteca de mutantes de E. coli indicou que, para que a inibição ocorra, as bactérias selvagens devem ser capazes de utilizar glicerol como fonte de carbono. Os resultados apontam para uma situação de tragédia dos comuns, onde o glicerol produzido pela hidrólise de G2P é consumido pelas bactérias selvagens antes que possa ser consumido pelos mutantes PHO-constitutivos. Em condições de baixa densidade de bactérias na placa seletiva, não ocorre inibição dos mutantes PHO-constitutivos. Neste caso foi possível calcular a real taxa de mutações PHO-constitutivas, que é da ordem de 2, 5 × 10-6 mutações/geração, estando dentro do esperado teórico para E. coli. Na segunda parte deste trabalho, foi caracterizado o sistema de transporte de fosfonatos, codificado por phnCDE. Um mutante espontâneo isolado em nosso laboratório, derivado de uma cepa ΔpitA ΔpstSCAB-phoU ΔugpBAEC apresentou a perda de uma inserção de 8 pb na ORF de phnE. Essa inserção é comum em derivados de E. coli K-12 e torna o transportador não funcional. Apesar de o mutante em questão portar deleções em todos os transportadores de Pi conhecidos, este conseguia crescer tendo Pi como única fonte de fósforo. Experimentos de crescimento e transporte de Pi mostraram que o sistema PhnCDE é, de fato, capaz de transportar Pi e o faz com uma eficiência similar à do transportador PitA. (AU) | |
| Processo FAPESP: | 15/13730-2 - Estudo do surgimento de mutantes PHO-constitutivos em Escherichia coli |
| Beneficiário: | Henrique Iglesias Neves |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Doutorado Direto |