Fatores de virulência do fungo Histoplasma capsulatum envolvidos na formação de biofilmes

Autor(es)

Nathália Ferreira Fregonezi

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Araraquara. 2020-11-10.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Araraquara
• Data de defesa: 2020-09-22
• Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida; Haroldo Cesar de Oliveira

Resumo

O fungo dimórfico Histoplasma capsulatum é o agente etiológico da histoplasmose, uma micose respiratória e sistêmica com casos distribuídos por todo o mundo. A patogenia da histoplasmose ocorre como resultado da inalação dos microconídeos da fase miceliar, que chegam primariamente aos pulmões, onde se transformam em leveduras, e, em seguida, podem se disseminar para outros órgãos. Diversos mecanismos podem estar envolvidos no processo de patogenia, permitindo o crescimento frente às diversas condições impostas pelo hospedeiro. Dentre estes, destaca-se os mecanismos para sobrevivência intracelular, e mais recentemente descrita, a capacidade de formar biofilmes. Desse modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o impacto da passagem por biofilmes na adesão e virulência das cepas EH-315 e G186A do fungo H. caspsulatum, além de avaliar o papel de diversas proteínas no estabelecimento desses biofilmes e na interação com o hospedeiro utilizando modelos in vitro e in vivo de infecção. Para a avaliação do perfil de virulência dos biofilmes durante a infecção, foram utilizadas as linhagens celulares A549 (epitelial pulmonar humano), J774 e RAW 264.7 (macrófagos murinos) e o modelo animal alternativo Galleria mellonela. Além disso, os biofilmes foram avaliados com relação a biomassa total, produção de matriz e atividade metabólica após o bloqueio das proteinas Enolase, 14-3-3, PL02996 e GAPDH, descritas como adesinas e importantes fatores de virulência para o gênero Paracoccidioides spp., e da proteína Hsp60, molécula de ligação de H. capsulatum aos macrófagos do hospedeiro, utilizando anticorpos específicos. O bloqueio das proteinas com seus respectivos anticorpos também foi utilizado como estratégia para avaliar a influência das proteínas na interação com o modelo G. mellonella. De acordo com os resultados obtidos, a cepa EH-315 demonstrou maior capacidade de interação com as células epiteliais pulmonares (A549) do que a cepa G186A, tanto após o cultivo planctônico (p<0,0001) quanto após a passagem por biofilme (p<0,05). Além disso, a passagem por biofilme aumentou a capacidade de interação em 32,26% para a cepa G186A, e 20,89% para a cepa EH-315. A interação com macrófagos também foi influenciada após a passagem por biofilme, tanto na interação com as células RAW 264.7, com aumento de 12,75% para a cepa G186A e 13,94% para a cepa EH-315, quanto na capacidade de proliferação intracelular em células J774, com aumento de 76,77% na proliferação após a passagem por biofilme na cepa EH-315. Apesar de ser capaz de estabelecer a infecção e reduzir a sobrevivência no modelo G. mellonella, não houve diferença significativa entre as curvas de sobrevivência das infecções com o fungo em cultivo planctônico e recuperado do biofilme. Entretanto, a passagem por biofilme induziu morte de forma mais precoce, e redução significativa (p<0,05) do número de hemócitos quando comparada com as larvas infectadas com o cultivo planctônico na cepa EH-315. Com relação à influência das proteínas nos biofilmes, o bloqueio das proteínas Enolase, 14-3-3, PL02996, Hsp60 e GAPDH ocasionou redução significativa da biomassa, conteúdo polissacarídico e atividade metabólica, demonstrando que são importantes para o processo de consolidação dos biofilmes. Com exceção da proteína 14-3-3 para a cepa EH-315, essas proteínas também parecem desempenhar papel importante para o estabelecimento da infecção no modelo alternativo G. mellonella, uma vez que o bloqueio levou ao aumento da sobrevivência das larvas (p<0,05). Mais estudos ainda precisam ser feitos para comprovar o papel dessas proteínas como novos fatores de virulência de H. capsulatum, porém, as proteínas estudadas demonstraram ser importantes na adesão ao substrato e formação dos biofilmes de H. capsulatum, e também para interação com o hospedeiro. Considerando a importância dos biofilmes do ponto de vista clínico, e a importância dos diferentes ligantes presentes no fungo interagindo com seus receptores no hospedeiro para o destino intracelular de H. capsulatum, o conhecimento do repertório de moléculas de superfície envolvidas com o processo de formação de biofilmes, bem como nas interações com as células do hospedeiro pode contribuir para uma melhor compreensão da biologia celular e virulência de H. capsulatum, além de providenciar novos alvos para serem explorados com abordagens antifúngicas. Além disso, os resultados encontrados demonstram evidências genéticas de similaridade em sequência, que sugerem a mesma atividade entre os fatores de virulência de Paracoccidioides spp. e H. capsulatum. Evidenciamos também a utilização do modelo G. mellonella para um posterior aprofundamento na avaliação da patogênese e perfil de resposta imunológica desencadeada por esse fungo. (AU)

• Processo FAPESP: 19/04882-4 - Identificação e avaliação de fatores de virulência do fungo Histoplasma capsulatum envolvidos na formação de biofilmes para identificação de novos alvos terapêuticos
• Beneficiário: Nathália Ferreira Fregonezi
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado