Estudo da reatividade de anticorpos monoclonais contra a fimbria PCF02 de Escherichia coli enterotoxigenica

Autor(es)

Viviane Delghingaro Augusto

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 1998-02-06

Membros da banca

Lucila Costallat Ricci; Maria Silvia Viccari Gatti; Beatriz E. C Guth

• Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro; Lucila Costallat Ricci

Resumo

Neste trabalho, foram criteriosamente avaliados nove anticorpos monoc1onais (MAbs) reativos para PCFO2, quanto ao reconhecimento de epítopos na fimbria purificada a partir de duas amostras diferentes, produtoras da mesma e também frente a outros fatores de colonização (PC) purificados, expressos por amostras de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) associada à diarréia humana. Em provas preliminares de "Western blot", este fator apresentou reações positivas não apenas frente aos soros polic1onais anti-PCFO2 como com anti-CF AII, anti-CF A/II (CSl, CS3), anti-CFA/II (CS2, CS3), anti-CFA/III, anti-CFA/IV (CS4, CS6) e anti-PCFO159. Provas de ELISA indireto, desenvolvidas tanto com os 4 MAbs pertencentes ao isotipo IgA, como com os 5 do isotipo IgG2b, confirmaram estes resultados, apenas frente aos FC do complexo CF A/II. Porém, em revelações no "Western blot" apenas bandas com pesos moleculares (p.M.) correspondentes à CSl, CS2, CS3, CFA/III, CS4 e CS6 foram reveladas, demonstrando apresentarem estes antígenos homologia de epítopos com PCFO2. Estes resultados foram confirmados, também de forma direta, em reações de imunomicroscopia eletrônica reveladas com os MAbs lDIC5, do isotipo IgA e 2C4F12, do isotipo IgG2b. Pesquisando-se diferenças de reconhecimento de epítopos entre os MAbs, buscou-se obter subunidades protéicas da fimbria PCFO2 após tratamento com 6M de Guanidina HCI-0,05M Tris. As frações obtidas após ultrafiltrações deste material, em membranas XM50 e YMIO, foram analisadas em SDS-P AGE e em provas de "Western blot". Pelos resultados obtidos, verificou-se a presença de uma única banda reconhecida pelos MAbs apresentando P.M. correspondente à PCFO2. Estes dados comprovam ser esta fimbria constituída por uma única subunidade protéica de 34,5 kDa. Após a avaliação da afinidade e especificidade das soluções preparadas com os 9 anticorpos monoc1onais em "Western blot", estes foram titulados por ELISA indireto, determinando-se que as preparações dos MAbs lDlC5 e 2C4F12 apresentavam maior título. Desta forma, estes foram selecionados para a padronização da Prova de Inibição do ELISA, avaliando-se, paralelamente, também os "pools" preparados com a mistura dos líquidos ascíticos dos dois diferentes isotipos. Assim sendo, a concentração do antígeno e dos MAbs foi padronizada, de tal forma que amostras expressando PCFO2 reduzissem a D.O. da reação controle para valores superiores a 50%. Na adequação da técnica, 66 cepas de E. coli, sendo 51 amostras ETEC e 16 não ETEC, foram avaliadas. Destas, 4 cepas isoladas de dois casos de diarréia no nosso meio, foram identificadas como produtoras de PCFO2 (AU)

• Processo FAPESP: 94/04250-9 - Estudo de anticorpos monoclonais reativos contra a fimbria pcfo2 de escherichia coli enterotoxigenica e padronizacao da prova de elisa na identificacao deste fator de colonizacao.
• Beneficiário: Viviane Delghingaro Augusto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado