Otimização de protocolo para análise proteômica dos fluidos lacrimais em pacientes com lesões orais potencialmente malignas e câncer de boca

Autor(es)

Erison Santana dos Santos

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Piracicaba, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Odontologia de Piracicaba
• Data de defesa: 2020-07-27

Membros da banca

Adriana Franco Paes Leme; Ariane Fidelis Busso Lopes; Pablo Agustin Vargas

• Orientador: Adriana Franco Paes Leme

Resumo

O carcinoma espinocelular (CEC) é o tumor maligno mais comum em cavidade oral. Essa neoplasia pode progredir a partir de alterações conhecidas como lesões orais potencialmente malignas, como a leucoplasia oral (LO) e a leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), que apresentam considerável incidência e alto potencial de malignização, respectivamente. Entretanto, o processo de malignização dessas lesões ainda não é totalmente conhecido. Portanto, encontrar assinaturas moleculares que possam predizer quais lesões sofrerão malignização pode antecipar o diagnóstico dos pacientes com CEC oral e melhorar o prognóstico. A biópsia líquida, como os fluidos lacrimais, é uma alternativa promissora não invasiva para busca por essas assinaturas. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi otimizar um protocolo de coleta, extração e digestão de proteínas dos fluidos lacrimais na perspectiva de utilizar esse fluido na busca por assinaturas de malignização. Esse projeto foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa, foi otimizado 12 protocolos em que as proteínas do fluido lacrimal de indivíduos saudáveis foram solubilizadas em agentes caotrópicos, solução de detergente, surfactante, agentes desnaturantes. As digestões com tripsina foram realizadas em solução ou em gel. As análises por meio de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) foram realizadas utilizando-se pelo menos dois gradientes de cromatografia líquida em diferentes espectrômetros de massas. O processamento dos dados para identificação e quantificação de proteínas foi realizado utilizando os softwares MaxQuant ou Mascot. As proteínas foram analisadas quanto: ao compartilhamento entre grupos pelo InteractiVenn; à localização dessas proteínas pelo The Human Protein Atlas e Uniprot e Uniprot; à predição de peptídeo sinal e hélice transmembrana pelo SignaIP, TMHMM; ao enriquecimento de processos biológicos pelo Enrichr e à interação proteína-proteína pelo String. Entre os protocolos testados, o que apresentou o melhor resultado foi o protocolo nomeado de P11, no qual as proteínas foram solubilizadas em ureia, digeridas em solução, com dupla digestão por tripsina, e os peptídeos resultantes foram separados em gradiente total de cromatografia líquida de 60 minutos e analisados no espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos e a busca pelos peptídeos foi realizada utilizando o software MaxQuat. Nesse protocolo, 209 proteínas foram identificadas, 72 apresentaram presença de peptídeos sinal e 23 apresentaram preditores de hélice transmembrana. No protocolo P11, o processo biológico mais associado à essas proteínas foi a homeostase da retina, e as proteínas que apresentaram maior evidência de interação proteína-proteína foram as queratinas. Na segunda etapa, após definição do melhor protocolo, foram coletadas e preparadas amostras referentes à 90 pacientes com LO, LVP, CEC oral e pacientes saudáveis para posterior análise por meio de LC-MS/MS. Em resumo, este estudo apresenta pela primeira vez a otimização de protocolos para análise de proteínas dos fluidos lacrimais visando a busca por assinaturas moleculares de malignização para antecipar a progressão do câncer de boca (AU)

• Processo FAPESP: 18/19922-9 - Análise proteômica dos fluidos lacrimais em pacientes com lesões orais potencialmente malignas e câncer de boca
• Beneficiário: Erison Santana dos Santos
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado