Enzyme and metabolic pathways prospection for the biosynthesis of vanilin and valorization of lignin from sugarcane bagasse

Autor(es)

Eduardo Cruz Moraes

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2017-12-14

Membros da banca

Fabio Marcio Squina; Fabiano Jares Contesini; Richard John Ward; Fernanda Mandelli

• Orientador: Thabata Maria Alvarez; Fabio Marcio Squina

Resumo

Lignina, um dos materiais mais recalcitrantes da natureza, consiste em um polímero tridimensional composto de vários anéis aromáticos ligados por ligações do tipo éter, estando presente em combinação com celulose e hemicelulose na parede celular vegetal. A lignina se encontra fortemente associada a polissacarídeos da parede celular, o que dificulta seu aproveitamento e praticamente inviabiliza seu isolamento na forma não alterada. Vanilina é um dos produtos da oxidação de lignina, e é obtida na forma natural a partir da vagem de orquídeas tropicais do gênero Vanilla. Devido à sua baixa produtividade e à dificuldade de cultivo fora de seu habitat natural, a demanda mundial por este produto vem sendo atendida através de síntese química a partir de recursos não renováveis como guaicol e ácido glioxílico. Recentemente, rotas fermentativas naturais têm sido desenvolvidas para a produção de vanilina a partir de fontes renováveis. Dada a importância comercial da molécula de vanilina, associada à demanda pela substituição de matérias primas não renováveis por matérias primas renováveis de baixo custo, é proposto neste trabalho o estabelecimento e caracterização de um consórcio de micro-organismos degradadores de lignina como estratégia para a valorização deste subproduto. Este consórcio foi criado através do cultivo de micro-organismos oriundos de solo de canavial em meio de cultura contendo uma solução de compostos provenientes de lignina. Esta solução é obtida através do processo de delignificação do bagaço de cana-de-açúcar, e é composta majoritariamente de compostos fenólicos de baixo peso molecular. Com o sequenciamento metagenômico do consórcio, foi possível ter acesso às enzimas e vias metabólicas envolvidas em processos de bioconversão destes compostos fenólicos. Como método para validação desta estratégia para a prospecção de enzimas lignolíticas, foram selecionadas as enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e enoil-CoA hidratase/aldolase (ech), seguido de ensaios enzimáticos com estas enzimas para avaliar a capacidade de conversão de ácido ferúlico em vanilina. A caracterização do consórcio revelou a capacidade dos micro-organismos presentes de degradar compostos fenólicos de baixo peso molecular do meio de cultura. Uma subsequente análise taxonômica indicou o enriquecimento do consórcio, com a diminuição da diversidade de micro-organismos em relação à amostra original de solo, e o aumento de espécies descritas na literatura como relacionadas à degradação de compostos aromáticos. Desta maneira, pode se observar a especialização do consórcio através da seleção de micro-organismos aptos a degradarem a lignina presente no meio. A análise do metagenoma do consórcio também permitiu a identificação de enzimas que participam na degradação de lignina e compostos aromáticos, tais como lacases, peroxidases e outras enzimas envolvidas no metabolismo de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). A partir dos dados de sequenciamento metagenômico, realizou-se a seleção in silico por análise de similaridade de sequência três enzimas feruloil-CoA sintetase (fcs) e duas enoil-Coa hidratase/aldolase (ech). Através de análises de eletroforese capilar e espectrometria de massas, verificou-se a produção de vanilina a partir de ácido ferúlico em ensaios enzimáticos com as enzimas selecionadas. Em paralelo, foram isolados micro-organismos capazes de crescer de forma autônoma em meios contendo lignina e com possível atividade lignolítica. Em especial, a cepa isolada de Paenarthrobacter sp. (denominada de HW13) se mostrou capaz de crescer em meio de cultura contendo apenas lignina kraft como fonte de carbono. Esta cepa foi também testada quanto a capacidade de crescimento/tolerância a diversos compostos fenólicos de reconhecida toxidade, bem como teve seu genoma sequenciado e comparado com um genoma de Paenarthrobacter obtido a partir dos dados de sequenciamento metagenômico do consórcio, revelando um alto grau de similaridade. Desta maneira, foi mostrado neste trabalho que a estratégia de estabelecimento de um consórcio degradador de lignina, aliado ao acesso de enzimas lignolíticas dos micro-organismos pelo isolamento dos mesmos e por ferramentas de metagenômica, consistem em formas efetivas de se obter rotas de bioconversão de compostos aromáticos oriundos de lignina. A obtenção de enzimas presentes nestas rotas possui o potencial de valorização da lignina de bagaço de cana através da conversão desta em moléculas de maior valor agregado (AU)

• Processo FAPESP: 14/26152-4 - Prospecção de enzimas e otimização de vias metabólicas para produção de vanilina a partir de lignina do bagaço de cana de açúcar
• Beneficiário: Eduardo Cruz Moraes
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado