Estudo funcional das proteínas MICU1 e MICU2 na sinalização por cálcio em Trypanosoma cruzi

Autor(es)

Mayara Santos Bertolini

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2018-04-10

Membros da banca

Anibal Eugenio Vercesi; Ariel Mariano Silber; Leonardo dos Reis Silveira

• Orientador: Miguel Angel Chiurillo Siervo; Anibal Eugenio Vercesi

Resumo

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, uma patologia que afeta milhares de pessoas e ainda não possui tratamento eficaz na fase crônica. A sinalização por cálcio no T. cruzi é importante, entre outras funções, para a invasão da célula hospedeira, diferenciação, osmorregulação, morte celular e função flagelar. O influxo de cálcio na mitocôndria, o qual é importante para homeostase do cálcio intracelular, ocorre através de um complexo uniporter de cálcio mitocondrial (MCUC) que é formado por diversos componentes, incluindo duas proteínas regulatórias da captação de cálcio mitocondrial (MICU1 e MICU2). Nos mamíferos essas proteínas estão localizadas no espaço intermembranas da mitocôndria e são sensíveis à concentração de cálcio citosólico, regulando a abertura do MCU. Embora vários componentes do MCUC tenham sido identificados em tripanossomatídeos, o mecanismo pelo qual ele é regulado ainda é desconhecido. Neste trabalho nós estudamos a função das proteínas MICU1 e MICU2 na captação de cálcio mitocondrial no T. cruzi. A predição das estruturas proteicas de TcMICU1 e TcMICU2 mostraram que há a presença de um domínio de sinal de endereçamento mitocondrial e domínios EF-hands, que seriam sensíveis à concentração de cálcio citosólico. Nós obtivemos linhagens celulares nocaute para TcMICU1 (MICU1-KO) e TcMICU2 (MICU2-KO) utilizando o sistema CRISPR/Cas9 co-transfectando epimastigotas de T. cruzi com o vetor Cas9/pTREX-n (contendo um RNA-guia) e um cassete linear de DNA com um gene de resistência a blasticidina para induzir o reparo da quebra das duas fitas de DNA por recombinação homóloga. Além disso, também geramos uma linhagem celular de epimastigotas de T. cruzi que superexpressam TcMICU2 marcadas com 2xHA (MICU2-OE) utilizando o vetor pTREX-n. Tais construções moleculares foram utilizadas para analisar o fenótipo dos mutantes e indicar quais as funções dessas proteínas. Nossos resultados mostram que MICU1-KO e MICU2-KO apresentam uma diminuição significativa na capacidade em captar cálcio pela mitocôndria, mostrando uma regulação diferente quando comparadas com o que já foi descrito anteriormente em mamíferos. Na ausência dessas proteínas há diminuição da taxa de crescimento e nas taxas de respiração dos epimastigotas, mostrando o quão elas são importantes para esse estágio de T. cruzi. Ademais, os epimastigotas MICU1-KO são capazes de se diferenciarem em tripomastigotas metacíclicos em maior proporção do que as células controle enquanto que a metaciclogênese in vitro foi diminuída nas células MICU2-KO. Usando a linhagem MICU2-OE, por sua vez, demonstramos a localização mitocondrial de TcMICU2 através de microscopia de fluorescência e a superexpressão dessa proteína não altera a capacidade em captar cálcio, assim como não afeta o potencial de membrana mitocondrial e o crescimento dos parasitas. Dessa forma, podemos concluir que as proteínas TcMICU1 e TcMICU2 são essenciais para a regulação da captação de cálcio pelo MCU em T. cruzi. Da mesma forma, os resultados sugerem que ambas as proteínas têm um papel importante no crescimento e diferenciação de epimastigotas (AU)

• Processo FAPESP: 15/25709-8 - Estudo funcional das proteínas MICU1 e MICU2 na sinalização por cálcio em Trypanosoma cruzi
• Beneficiário: Mayara Santos Bertolini
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado