Avaliação da via TP53/TP73 na enxertia de células de leucemia promielocítica aguda em modelo de xenotransplante

Autor(es)

Diego Antonio Pereira Martins

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2022-05-02

Membros da banca

Eduardo Magalhães Rego; José Barreto Campello Carvalheira; Emmanuel Griessinger; Fabíola Traina

• Orientador: Eduardo Magalhães Rego

Resumo

Os atuais modelos murinos de xenotransplante utilizados como modelos de estudo in vivo dos processos leucêmicos humanos, particularmente na leucemia mieloide aguda (LMA) tem falhado na reconstrução dos processos fisiopatológicos relacionados a doença devido a não similaridade com o nicho medular humano. Deste modo, a avaliação dos processos de alto-renovação, diferenciação e transformação das células tronco hematopoiéticas humanas (HSCs) e leucêmicas (LSCs), bem como sua avaliação quanto a eficácia de novas modalidades de tratamento, devem ser realizadas em microambientes espécie-específicos. Isto é suportado pelo fato de alguns subtipos leucêmicos (presentes no grupo de prognóstico favorável da doença), como a leucemia promielocítica aguda (LPA), apresentam recorrente falha de enxertia em modelos de xenotransplante. Apesar do seu prognóstico favorável frente a outros subtipos de LMA, este subtipo ainda apresenta elevado risco de recaída frequentemente associado a resistência a terapia utilizada. Neste sentido, acredita-se que variações genéticas que confiram maior resistência ao clone leucêmico podem influenciar na capacidade de enxertia destas células, favorecendo sua avaliação in vivo. Estudos prévios do nosso grupo demonstraram que uma maior relação de expressão ΔNp73/TAp73 está associada com pior prognóstico na LPA (menor sobrevida global [SG] e sobrevida livre de doença [SLD]) e resistência à apoptose induzida por citarabina. O ΔNp73, forma truncada do gene TP73, atua como um potente inibidor da atividade transcricional das proteínas TP53 e TAp73, desempenhando, desta forma, um importante papel na proliferação e morte celular. Assim, a atividade oncogênica do gene TP73 é determinada pelo balanço entre suas isoformas transcricionalmente ativa (TAp73) e inativa (ΔNp73), e essa relação correlaciona-se com o prognóstico clínico e falha no tratamento em diversas neoplasias humanas. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar se alterações na via do TP53/TP73 estão associadas com uma maior capacidade de enxertia em células de pacientes com LPA em modelos de xenotransplante humanizados. Subjacente a isto, investigamos os mecanismos pelos quais a via TP53/TP73 podem conferir às células PML-RARA+ vantagens de enxertia, tais como modificações na proliferação, viabilidade e diferenciação celular. Ademais, avaliamos o transcriptoma de pacientes com LPA e LMA com diferentes níveis de expressão do ΔNp73/TAp73, a fim de identificar possíveis alvos de regulação do TP53/TP73. Em células CD34+ isoladas de doadores saudáveis, a hiperexpressão das isoformas ΔNp73α/β resultou em aumento da capacidade de proliferação e formação de colônias em culturas de longa duração (35 dias) em comparação com o vetor vazio (pMEG). Nas linhagens de LPA (NB4 e NB4-R2), a hiperexpressão do ΔNp73α/β promoveu um aumento da proliferação, viabilidade celular em resposta a agentes citotóxicos, e menor diferenciação granulocitíca induzida pelo ácido all-trans retinóico. De maneira inversa, a superexpressão de TAp73α promoveu a reversão de todos os fenótipos observados com o ΔNp73, resultando em sensibilização ao trióxido de arsênico (ATO) em um modelo de LPA resistente ao ATO. Estes achados foram validados utilizando a linhagem Ba/F3-PML-RARA transduzida com as diferentes isoformas do TP73. Ademais, o xenotransplante de animais NSGS com células primárias de pacientes com LPA, transduzidas com o pMEG e o ΔNp73α demonstrou que as células ΔNp73α apresentaram um maior potencial de enxertia na medula óssea, sangue periférico e baço dos animais. No contexto da LMA, pacientes com alta expressão das isoformas ΔNp73 apresentaram maiores contagens de leucócitos, sendo a razão ΔNp73/TAp73 associada com menor SG e SLD. Ademais, ao nível transcricional, pacientes com alto ΔNp73 apresentaram enriquecimento para os processos associados com \"HSC UP\" e \"LSC UP\", e negativamente correlacionados com os termos \"GMP UP\" e \"TP53 regulates cell cycle arrest\". Em modelos celulares, a superexpressão das isoformas ΔNp73α/β resultou em vantagens proliferativas e de sobrevivência celular nos modelos celulares que não continham mutações no gene TP53 (MOLM13, MV4-11, OCI-AML3 e HL60), embora nenhum efeito tenha sido observado nas linhagens celulares contendo mutações em TP53 (TF-1 e KG1). O silenciamento da expressão do gene TP53 em linhagens TP53 wild-type reduziu os efeitos da superexpressão das isoformas ΔNp73α/β. Mecanisticamente, elevada expressão de ΔNp73 resultou em redução da expressão de TP53 e aumento da expressão de DHODH, cujo efeitos puderam ser revertidos com o uso do inibidor farmacológico de DHODH - Brequinar, em combinação com o agente demetilante Decitabina. Em conclusão, a hiperexpressão das isoformas ΔNp73 conferiu vantagens de sobrevivência celular as células de LMA, resultando na enxertia das células primarias de pacientes diagnosticados com LPA em modelo de xenotransplante. (AU)

• Processo FAPESP: 17/23117-1 - Avaliação da via TP53/TP73 na enxertia de células de leucemia promielocítica aguda em modelo de xenotransplante
• Beneficiário: Diego Antonio Pereira Martins
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado