Sensores biológicos de capacitância eletroquímica sem marcagem para o diagnóstico molecular

Autor(es)

Beatriz Lucas Garrote

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Araraquara. 2022-11-11.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Química. Araraquara
• Data de defesa: 2022-10-21
• Orientador: Paulo Roberto Bueno

Resumo

Os recentes avanços da biomedicina e da tecnologia fizeram com que a popularização do diagnóstico molecular se refere ao uso de técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou o ensaio imunoenzimático (ELISA), para analisar marcadores biológicos (por exemplo, proteínas, ADN ou ARN). Tanto o PCR quanto o ELISA foram aprimorados ao longo dos anos com uma ampla gama de aplicações. No entanto, ambas as técnicas apresentam limitações que dificultam seu acesso em países em desenvolvimento ou sua aplicação em campo, pois ambas necessitam de equipamentos caros e de grande porte com fonte de energia estável, reagentes caros e etapas adicionais, que as tornam demoradas ensaios e pessoal altamente qualificado para executar os ensaios. Os dispositivos de diagnóstico molecular no ponto de atendimento (POC ou teste à beira do leito) parecem superar essas limitações devido à facilidade de usar dispositivos portáteis para examinar clinicamente um paciente durante uma consulta em que médicos e pacientes não precisam mais aguardar os resultados do laboratório para fazer um diagnóstico adequado. Portanto, os dispositivos POC têm potencial para se tornar a ferramenta de atenção primária para o diagnóstico de doenças em que o tempo de detecção é fundamental para iniciar o tratamento, como é o caso das doenças não transmissíveis (DCNT), e para evitar a disseminação de agentes infecciosos, como é o caso das doenças infecciosas, reduzindo a probabilidade de surtos e múltiplos óbitos. Os dispositivos de diagnóstico molecular POC são popularmente conhecidos como biossensores que são constituídos por três elementos: receptor, transdutor e sistema de saída. Dentre eles, o transdutor é o elemento principal, pois é responsável por converter o sinal biológico/químico da interação analito-receptor em um sinal elétrico legível pelo sistema de saída. O reconhecimento do analito pelo transdutor pode ser diretamente (ou seja, sem rótulo) em apenas uma etapa sem reagentes adicionais (sem reagente) pela variação de uma propriedade inerente do transdutor; ou indiretamente (isto é, baseado em rótulo) usando etapas adicionais para rotulagem de analito ou moléculas rotuladas adicionais. Essa exigência aumenta a duração, o custo e a dificuldade de manuseio do ensaio, de modo que as metodologias sem rótulo e sem reagente são mais apropriadas para dispositivos POC. Esses requisitos são atendidos por meio de transdutores baseados em capacitância eletroquímica que também oferece alta sensibilidade e possibilidade de miniaturização. Os transdutores eletroquímicos capacitivos são compostos por uma nanoestrutura redox-ativa imobilizada na superfície do eletrodo com níveis de energia discretos. Esses transdutores usam espectroscopia de capacitância derivada de impedância como técnica eletroquímica derivada de medidas de EIS que mede a capacitância eletroquímica (C_μ) dessas nanoestruturas eletroativas. C_μ é uma característica intrínseca dessas nanoestruturas eletroativas com espessura < 5nm, relacionada ao armazenamento de energia e densidade de estados (DOS) da interface. Os biossensores C_μ são modelados pela teoria da taxa quântica que resolve a dinâmica quântica da transferência de elétrons (ET) em reações eletroquímicas sem difusão, como uma das interfaces eletroativas, dada por k=G/C_μ, onde k é a taxa de transferência de elétrons e G é a condutância quântica que mede o transporte de carga dentro do eletrodo e da interface eletroativa. Esta teoria demonstrou que em uma situação ideal de transferência de elétrons, G=G_0, onde G_0=g_s e^2/h ~ 77,5 μS é o quantum de condutância. Além disso, demonstrou que C_μ é uma consequência da combinação em série de uma capacitância eletrostática (C_e) e quântica (C_q), como 1/C_μ=(1/C_e)+(1/C_q), onde C_e surge da carga separação (l) devido à solvatação dos comutadores eletroativos e C_q emerge da ocupação dos níveis de energia dentro da transferência de carga com o eletrodo através da espinha dorsal da molécula eletroativa (L). Na maioria das interfaces quânticas C_μ, l≪L, então C_e≫C_q, 1/C_e é próximo de zero e C_μ~C_q. De acordo com essas aproximações, k=G_0/C_q, demonstrando que interfaces eletroativas operam em regime puramente quântico, tornando-as transdutores de alta sensibilidade para aplicações de biossensores. A versatilidade e alta sensibilidade dos transdutores C_q os convertem em uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de ensaios analíticos em uma vasta gama de aplicações qualitativas ou quantitativas. Neste doutorado projeto propusemos o uso de transdutores eletroquímicos de capacitância para desenvolver novos ensaios de biossensor para o diagnóstico de doenças relevantes: infecção por SARS-CoV-2 pela detecção de proteína spike (SP) e proteína nucleocapsídica (NP) em amostras nasofaríngeas/orofaríngeas; Infecção pelo vírus da dengue pela quantificação da proteína NS1 em amostras de soro; e doença de Alzheimer (DA) pela quantificação das proteínas ptau-181 e ADAM10 em amostras de soro humano. O SARS-CoV-2 é o novo membro circulante da família Coronaviridae que se espalhou rapidamente pelo mundo e se tornou uma ameaça à saúde global. O desenvolvimento de biossensores tornou-se prioridade até o desenvolvimento das vacinas. Nesta tese de doutorado, o ensaio SARS-CoV-2 desenvolvido detectou a presença das proteínas virais S e N em amostras humanas nasofaríngeas/orofaríngeas com 77% de especificidade e 80% de sensibilidade, superior aos ensaios rápidos comerciais gerais. O vírus da dengue também constituiu uma ameaça à saúde em alguns países tropicais, como o Brasil. Dispositivos POC eficientes podem fornecer detecção rápida da infecção e monitoramento da progressão da doença para dengue hemorrágica mais grave. Assim, neste projeto desenvolvemos um ensaio de vírus Dengue miniaturizado e de alta sensibilidade para a quantificação da proteína viral NS1. Uma nova metodologia de sinal amplificador foi acoplada ao ensaio que aumentou em até 1000 vezes sua sensibilidade, possibilitando a detecção do vírus desde o início da infecção. Além disso, nesta tese de doutorado, os transdutores C_q foram aplicados na primeira quantificação sem marcação de dois biomarcadores séricos de DA, ADAM10 e ptau-181. Dois ensaios de ADAM10 foram desenvolvidos usando dois anticorpos que reconheceram isoformas distintas de ADAM10. As características analíticas de cada ensaio foram resolvidas por medições no transdutor C_q que permitem a determinação da constante de associação (K_a), limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ). Ambos os ensaios demonstraram K_a e LODs e LOQs semelhantes na faixa de nanogramas por mililitro. Além disso, a especificidade de cada ensaio foi analisada pela quantificação da proteína em amostras de soro de pacientes com DA e indivíduos saudáveis. No caso do ensaio ptau-181, a faixa de concentração em amostras de soro humano foi de picograma por mililitro, então três transdutores C_q diferentes baseados em uma monocamada automontada de peptídeo redox (SAM), o peptídeo redox SAM acoplado à metodologia de sinal amplificador e um ensemble de pontos quânticos de CdTe, foram analisados ​​em termos de LOD e LOQ para avaliar qual deles seria adequado para a aplicação. A sensibilidade do rPep SAM não foi suficiente para quantificar a proteína em tal faixa de concentração, enquanto a alternativa com o sinal amplificador e os transdutores baseados em QD foram adequados para a aplicação. Em resumo, nesta tese de doutorado foi demonstrado o potencial da técnica de capacitância eletroquímica para o desenvolvimento de transdutores para dispositivos POC. A versatilidade da técnica possibilita uma vasta gama de aplicações que exigem diversas características analíticas. Assim, os objetivos propostos no início deste projeto foram alcançados com sucesso e novas perspectivas para pesquisas futuras foram criadas. (AU)

• Processo FAPESP: 18/26273-7 - Biossensores label-free baseados em capacitância eletroquímica para o diagnóstico de doenças
• Beneficiário: Beatriz Lucas Garrote
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado